Regulation of alternative splicing and polyadenylation by genotoxic anti-cancer agents

La plupart des gènes humains codants génèrent des transcrits alternatifs (isoformes) par épissage alternatif (alternative splicing, AS) et polyadénylation alternative (APA) en général dans la région codante et la région 3’ non traduite (3’UTR), respectivement. Le rôle de l’AS et la 3’UTR-APA est de plus en plus reconnu dans l’oncogenèse. En particulier, des réseaux d’AS connectant des facteurs d’épissage et des variants d’épissage ont récemment été identifiés. L’AS est aussi largement régulé par les agents anticancéreux génotoxiques, tel que la doxorubicine et le cisplatine (induisant des différents types de lésions sur l’ADN), qui sont régulièrementt utilisés dans les traitements du cancer du sein et du poumon non-à-petites-cellules (non-small-cell lung cancer, NSCLC), respectivement. Étant donné l’apparition fréquente de résistances aux chimiothérapies, comprendre les mécanismes sous-jacents est crucial pour surmonter ce problème clinique. Il existe des exemples d’évènements d’AS associés à la résistance aux agents anticancéreux, mais l’implication des facteurs d’épissage et des réseaux d’AS est très peu connue. De plus, une étude précédente a démontré que la doxorubicine réprime un grand groupe d’exon terminaux alternatifs (alternative last exons, ALE), qui correspondent à l’utilisation de sites de polyadénylation introniques (intronic polyadenylation, IPA). Les ALEs ont un rôle émergent dans le cancer, mais on ne sait encore que très peu sur leur régulation par d’autres agents anticancéreux, tel que le cisplatine. Afin de mieux comprendre le rôle des régulations d’AS et d’APA dans la réponse et la résistance cellulaire à la chimiothérapie, mon projet de thèse avait deux objectifs principaux : 1) déterminer l’étendue, les réseaux régulateurs, et les fonctions des régulations d’AS dans la résistance à la doxorubicine des cellules de cancer du sein, et 2) déterminer l’étendue, les mécanismes, et l’impact des régulations d’ALE en réponse au cisplatine dans des cellules de NSCLC. Dans la première partie, j’ai identifié par RNA-seq des milliers d’évènements d’AS et des dizaines de facteurs d’épissage régulés dans un modèle cellulaire de cancer du sein ER+ résistant à la doxorubicine. Par un miniscreen siARN, j’ai identifié deux facteurs, ZRANB2 et SYF2, impliqués dans la résistance à la doxorubicine. D’autres analyses RNA-seq ont révélé les évènements d’AS régulés par ces deux facteurs peu étudiés, ainsi que leur convergence vers l’exon 5 alternatif de l’oncogène ECT2. La déplétion de ZRANB2, SYF2, et du variant ECT2-ex5 réduit l’arrêt en phase S induit par la doxorubicine et la résistance des cellules. De plus, un niveau élevé d’inclusion de l’exon 5 d’ECT2 corrèle avec une mauvaise survie spécifiquement de patientes ER+ traitées par chimiothérapie. Dans la deuxième partie, j’ai identifié par 3’-seq que le traitement cisplatine (mais pas oxaliplatine) induit des ALEs/IPAs dans des milliers de gènes enrichis en gènes de cycle et de mort cellulaire. Cet effet est lié à une inhibition de la processivité de l’élongation dans les longs gènes. Une analyse 3’-seq sur polysomes m’a permis de montrer que ces régulations d’ALEs impactent le traductome, et a révélé un groupe d’isoformes particulièrement courtes peu efficacement traduites, dont un transcrit connu avec une fonction non-codante. En conclusion, j’ai pu identifier durant ma thèse un nouveau réseau d’AS impliqué dans la résistance à la doxorubicine des cancers du sein ER+, et une importante régulation d’ALEs impactant le traductome en réponse au cisplatine dans des cellules NSCLC. Ces travaux améliorent notre compréhension du rôle de l’AS et des ALE/IPA dans la réponse et la résistance cellulaire à la chimiothérapie anticancéreuse. Au plus long terme, les transcrits alternatifs et les régulateurs identifiés constituent des biomarqueurs candidats de chimiorésistance.Most human coding genes generate alternative transcripts (isoforms) through alternative splicing (AS) and alternative polyadenylation (APA), most often within the coding region and the 3’ untranslated region (3’UTR), respectively. Both AS and 3’UTR-APA regulations have been increasingly involved in oncogenesis. In particular, AS networks connecting oncogenic splicing factors and oncogenic splicing variants have been recently identified. AS is also widely regulated by genotoxic anticancer drugs, like doxorubicin and cisplatin that induce different types of DNA lesions and are widely used in breast cancer and non-small-cell lung cancer (NSCLC) therapy, respectively. Given the frequent occurrence of resistance to chemotherapy, understanding the underlying mechanisms is crucial to overcome this major issue. There are examples of AS events associated with anticancer drug resistance, but very little is known about the splicing factors and therefore the AS networks involved. In addition, a previous study showed that doxorubicin represses a large set of alternative last exons (ALE) corresponding to the use of intronic polyadenylation (IPA) sites. ALEs have an emerging role in cancer, but little is known about its regulation by other anticancer drugs, like cisplatin. In order to better understand the role of AS and APA regulation in cell response and resistance to chemotherapy, my PhD project had two main aims: 1) determine the extent, regulatory networks and function of AS regulation in breast cancer cell resistance to doxorubicin, and 2) determine the extent, mechanism and impact of ALE regulation in response to cisplatin in NSCLC cells. In the first part, I identified by RNA-seq thousands of AS events and dozens of splicing factors regulated in a cell model of acquired resistance to doxorubicin in ER+ breast cancer. Through an siRNA miniscreen, I found two splicing factors, ZRANB2 and SYF2, involved in doxorubicin resistance. Further RNA-seq analyses revealed the AS events regulated by depletion of these poorly characterized splicing factors, and their convergence on the alternative exon 5 of the oncogene ECT2. Depletion of ZRANB2, SYF2 and the ECT2-Ex5 variant reduces doxorubicin-induced S phase arrest and doxorubicin resistance. In addition, high inclusion levels of ECT2-Ex5 correlate with poor survival specifically in ER+ breast cancer treated with chemotherapy. In the second part, I found by 3’-seq that in NSCLC cell treatment with cisplatin (but not oxaliplatin) induces ALE/IPA in thousands of genes enriched in cell cycle and cell death. This effect is linked to an inhibition of transcription elongation processivity in long genes. 3’-seq analysis on polysomes showed that this ALE regulation impacts the translatome, and revealed a set of particularly short isoforms that were inefficiently translated, including a transcript with a non-coding function. In conclusion, during my thesis, I could identify a novel AS network involved in doxorubicin resistance in ER+ breast cancer, and widespread ALE regulation impacting the translatome in lung cancer cisplatin response. This work increases our understanding of AS and IPA role in cell response and resistance to anti-cancer chemotherapy. In the longer term, the identified alternative transcripts and regulators constitute candidate biomarkers of chemoresistance