Selection and engineering of aptamers using high-throughput sequencing

Le SELEX est une technique d’évolution moléculaire dirigée qui permet, après plusieurs tours de sélection, d’enrichir une banque d’acides nucléiques en séquences capable de se lier de manière spécifique à une cible. Le séquençage est utilisé pour identifier ces séquences que l’on nomme « aptamères ». Depuis l’arrivée récente du séquençage à haut débit (HD), il est possible d’analyser des millions de séquences. L’objectif de la thèse était de développer des méthodes pour traiter et analyser les données de séquençage HD afin de faciliter l’identification des meilleurs aptamères d’un SELEX. Au cours de cette thèse, un test robotisé de liaison sur cellules adhérentes vivantes a été mis au point pour mesurer l’affinité d’aptamères issus de SELEX ciblant des cellules (cell-SELEX). Puis, l’évolution de l’abondance des séquences d’un cell-SELEX a été analysée par séquençage HD. Ceci nous a permis de concevoir une nouvelle approche phylogénétique baptisée FREDROGRAM. Cette approche évolutive a permis d’identifier des mutants avec une meilleure affinité au sein d’une famille d’aptamères issu de ce cell-SELEX. Enfin, le séquençage HD de deux SELEX dirigés contre des protéines a contribué à mieux comprendre l’impact des paramètres de sélection sur la population de séquences et à identifier de nouveaux aptamères, notamment en réduisant le nombre de tours de SELEX. En conclusion, ces travaux montrent l’utilité du séquençage HD pour l’identification des meilleurs aptamères et suggèrent de nouvelles pratiques pour la conduite des SELEX futurs.SELEX is a directed molecular evolution technic which allows, after several rounds of selection, enriching a library from random nucleic acids to sequences able to bind specifically a target. Sequencing technics are then used to identify these sequences called « aptamers ». Since the arrival of High-Throughput Sequencing (HTS), it is now possible to analyse millions of sequences. The aim of the thesis was to develop methods for the treatment and the analysis of HTS data, in order to facilitate the identification of the best aptamers inside a SELEX. During this thesis, a semi-automatic binding test on adherent living cells has been developed to measure the affinity of aptamers identified in SELEX directed against specific cells (cell-SELEX). Then, the evolution of the sequence enrichment during a cell-SELEX has been analysed by HTS. This analysis gave us the possibility to design a new phylogenetic approch named FREDROGRAM. This evolutive approch allowed to identify variants of an aptamer’s family with a better affinity. Finally, HTS of two SELEX directed against proteins has contributed to a better understanding of the impact of selection parameters on the library and to identified new aptamers, notably by reducing the number of SELEX rounds. To conclude, this work shows the importance of HTS in the identification of the best aptamers and suggests new protocols to monitor the next SELEX in a different manner