Antimicrobial agents targeting complex III of mitochondrial respiratory chain : characterization of new inhibitors and study of the resistance development

Des inhibiteurs du complexe bc1 de la chaîne respiratoire mitochondriale ont été développés comme agents antimicrobiens pour lutter contre des pathogènes de l’Homme et de plantes. Ces drogues ciblent les poches catalytiques Qo et Qi formées par le cytochrome b. La comparaison de séquences de cette protéine montre que les sites Qo et Qi sont bien conservés entre les organismes mais qu’il existe toutefois des variations qui pourraient expliquer leur différence de sensibilité aux drogues. A l’aide du modèle levure S. cerevisiae, nous avons étudié les déterminants de la résistance/sensibilité naturelle à deux antipaludiques se liant au site Qo de Plasmodium: l’atovaquone et RCQ06. Nous avons notamment montré que le résidu 275 joue un rôle clé dans ce phénomène. Une approche similaire est actuellement utilisée pour identifier les facteurs de la sensibilité différentielle à deux drogues ciblant le site Qi des oomycètes. Malheureusement, des cas de résistance acquise à ces antimicrobiens ont été rapportés et ont pour origine des mutations dans le cytochrome b. De ce fait, de nouvelles molécules sont requises pour court-circuiter ces résistances. Au cours de ma thèse, nous avons mis au point un test qui permet de cribler des molécules capables d’inhiber la fonction respiratoire. Nous avons ainsi pu identifier un nouvel inhibiteur du complexe bc1 : D12. Nous avons ensuite déterminé le mode de liaison de cette molécule ainsi que celui d’un composé capable d’inhiber la prolifération de Plasmodium, HDQ, grâce à une collection de mutants des poches catalytiques. HDQ s’est avéré être un inhibiteur du site Qi. Il pourrait être utilisé avec un inhibiteur du site Qo afin de limiter l’apparition de mutations de résistance. D12 est un inhibiteur du site Qo qui est capable notamment de court-circuiter la mutation de résistance à des fongicides du site Qo G143A. Cette dernière a été trouvée chez de nombreux phytopathogènes, mais n’est cependant pas apparue chez des champignons possédant un intron immédiatement après le codon codant pour la glycine 143. En utilisant la levure, nous avons montré que la mutation empêche l’épissage de l’intron en altérant la structure exon/intron. Nous avons également identifié des mécanismes de « by-pass » qui permettent de restaurer la fonction respiratoire du mutant et qui pourraient apparaître chez les pathogènes. Les mutants créés au cours de ma thèse pourront aider à identifier, concevoir et caractériser de nouveaux antimicrobiens et à étudier l’apparition de mutations de résistance.Inhibitors of the mitochondrial respiratory chain bc1 complex are currently used against human and plant pathogens. These drugs bind to Qo and Qi pockets of the mitochondrially-encoded cytochrome b. Comparison of the cytochrome b sequences shows that the Qo and Qi sites are well conserved between organisms. However, there are variations that could explain the differential sensitivity to respiratory inhibitors. In order to investigate the determinants of resistance / sensitivity to the antimalarial compounds, atovaquone and RCQO6, we used S.cerevisiae as a model. We showed that residue 275 plays a central role in the sensitivity to these drugs. We are now using a similar approach to identify the determinants of sensitivity towards two drugs targeting the oomycete Qi site. Unfortunately, cases of acquired resistance to these antimicrobial agents have been reported. They are caused by mutations in the cytochrome b. Thus, new molecules are required to bypass resistance. During my PhD, we developed a test to screen chemical libraries and identify inhibitors of the respiratory function. We identified a novel inhibitor of bc1 complex: D12. We determined the binding mode of D12 as well as of HDQ, a compound capable of inhibiting the proliferation of Plasmodium. To do this, we used a collection of mutants with alterations of the catalytic pockets. We showed that HDQ targets the Qi site. This finding suggests that HDQ could be used with an inhibitor of the Qo site to limit the emergence of resistance mutations. D12 is an inhibitor of Qo site and fully active against the enzyme harbouring the fungicide resistance mutation G143A. This mutation has been reported in many plant pathogenic fungi but has not evolved in fungi that harbour an intron immediately after the codon for G143. Using yeast, we showed that the mutation hinders the splicing of this intron by altering the exon / intron structure needed for efficient intron excision. We also identified by-pass mechanisms that restore respiratory function of the G143A mutant. These mechanisms identified in yeast could potentially arise in pathogenic fungi. Mutants created during my PhD will help to identify, design and characterize new drugs and to study the emergence of resistance mutations