Understanding the Involment of Fungal Effectors during Infection : Functional Characterization of Leptosphaeria Maculans Effectors, a Fungal Pathogen of Oilseed Rape

Pendant l’infection, les agents phytopathogènes sécrètent un arsenal de molécules, appelées effecteurs, éléments clés de la pathogénie qui modulent l’immunité innée de la plante et facilitent l’infection. Leptosphaeria maculans est le champignon responsable de la nécrose du collet du colza. Plus de 650 gènes codant des effecteurs potentiels ont été identifiés dans son génome, dont 7 ont un rôle reconnu dans l’avirulence du champignon. Les effecteurs fongiques correspondent principalement à de petites protéines potentiellement sécrétées (PPS), n’ayant pas d’homologues dans les bases de données et pas de motifs connus. Par conséquent, leur fonction biologique est difficile à prédire, et très peu de choses sont connues sur le mode d’action des effecteurs de L. maculans au cours de l’infection.L’objectif de ma thèse était de caractériser fonctionnellement des effecteurs de L. maculans afin de mieux comprendre leur rôle au cours du processus infectieux. Cette caractérisation fonctionnelle a consisté en : i) la détermination de la localisation subcellulaire de ces effecteurs dans Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana ; ii) la recherche de cibles végétales ciblées par ces effecteurs ; et iii) la détermination des processus cellulaires impactés par ces effecteurs par expression stable dans A. thaliana et tests de suppression de mort cellulaire dans N. benthamiana. Quatre effecteurs ont été choisis pour cette étude : AvrLm10-1, AvrLm10-2, AvrLm4-7 et AvrLm3.AvrLm10-1 et AvrLm10-2 sont tous les deux nécessaires pour induire une reconnaissance par le gène de résistance Rlm10. Des orthologues d’AvrLm10-1 et AvrLm10-2 ont été identifiés chez des Dothidéomycètes et des Sordariomycètes phytopathogènes ainsi que plusieurs paralogues exprimés spécifiquement pendant l’infection chez L. maculans. AvrLm10-1 et AvrLm10-2 présentent toutes les deux une localisation nucléo-cytoplasmique. Une interaction physique entre AvrLm10-1 et AvrLm10-2 a été mise en évidence, ainsi qu’une interaction potentielle de ces deux protéines avec une protéine PR1 (Pathogenesis-related 1) et une cystéine-protéase végétale.AvrLm4-7 est reconnu par deux gènes de résistance, Rlm4 et Rlm7, et sa présence empêche la reconnaissance d’AvrLm3 par Rlm3. AvrLm4-7 est capable de supprimer la mort cellulaire provoquée aussi bien par des inducteurs généraux de la mort cellulaire que par des inducteurs de la PAMP-Triggered Immunity (PTI) et de l’Effector-Triggered Immunity (ETI). AvrLm4-7 présente une localisation nucléo-cytoplasmique, qu’il soit exprimé avec ou sans son peptide signal, ce qui suggère un mode d’action intracellulaire. AvrLm4-7 interagit potentiellement avec une protéine ribosomale végétale, de la même manière qu’un effecteur de Blumeria graminis avec lequel il partage des analogies structurales. Cependant, des lignées d’A. thaliana exprimant AvrLm4-7 de façon constitutive ne présentent aucune différence morphologique ou de sensibilité aux maladies comparativement à l’écotype sauvage Col0.AvrLm3 est un gène d’avirulence très conservé dans les populations de L. maculans dont la reconnaissance par le gène de résistance Rlm3 est supprimée en présence d’AvrLm4-7. AvrLm3 est capable de supprimer la mort cellulaire associée à la PTI et à l’ETI. Cet effecteur est localisé dans l’apoplasme des cellules foliaires lorsqu’il est exprimé avec son peptide-signal, suggérant un mode d’action extracellulaire. AvrLm3 interagit potentiellement avec une myrosinase-associated proteine sécrétée impliquée dans le système myrosinase-glucosinolate, suggérant qu’AvrLm3 perturberait la synthèse des glucosinolates, ce qui est un mode d’action inédit pour un effecteur d’agent phytopathogène.Cette thèse a permis de mieux comprendre le mode d’action des effecteurs de L. maculans et de proposer de nouvelles stratégies de contrôle des maladies fongiques.During infection, plant pathogens secrete an arsenal of molecules collectively known as effectors that circumvent plant innate immunity and trigger infection. The phytopathogenic fungus Leptosphaeria maculans is the causal agent of stem canker of oilseed rape. More than 650 putative effector-encoding genes have been identified in its genome, 7 of them corresponding to avirulence genes. Fungal effectors mainly correspond to small secreted proteins (SSP) with no known homologs and no predicted functions. Their biological function is therefore difficult to predict, and very little is known about the mode of action of L. maculans effectors during infection.The objective of my thesis was to elucidate the role of L. maculans effectors during infection through their functional characterization which included: i) the determination of their subcellular localization in Nicotiana benthamiana et Arabidopsis thaliana; ii) a search for their plant targets; and iii) the determination of the cellular processes targeted by those effectors through their stable expression in A. thaliana and by testing their ability to suppress cell-death in N. benthamiana. We investigated four effectors in that study: AvrLm10-1, AvrLm10-2, AvrLm4-7 and AvrLm3.AvrLm10-1 and AvrLm10-2 are both necessary to trigger recognition by the Rlm10 resistance gene. We have identified orthologs for AvrLm10-1 and AvrLm10-2 in Dothideomycetes and Sordariomycetes phytopathogens, and several paralogs in L. maculans which are expressed specifically during oilseed rape infection. AvrLm10-1 and AvrLm10-2 both have a nucleo-cytoplasmic localization. AvrLm10-1 and AvrLm10-2 physically interact, and may also interact with a PR1 (Pathogenesis-related 1) protein and a secreted cysteine-protease. AvrLm4-7 is recognized by two resistance genes, Rlm4 and Rlm7, and suppresses recognition of AvrLm3 by Rlm3. AvrLm4-7 suppresses cell-death triggered by general inducers, PAMP-Triggered Immunity (PTI) and Effector-Triggered Immunity (ETI). AvrLm4-7 has a nucleo-cytoplasmic localization, whether expressed with or without its signal peptide, suggesting an intracellular mode of action. One of the potential plant targets for AvrLm4-7 is a ribosomal protein, just like a Blumeria graminis effector with structural analogy to AvrLm4-7. Transgenic lines of A. thaliana constitutively expressing AvrLm4-7 do not show any morphological phenotypes or any difference in their susceptibility to diverse fungal pathogens. AvrLm3 is an avirulence gene strongly conserved in L. maculans populations. Recognition of AvrLm3 by Rlm3 is suppressed by the presence of AvrLm4-7. AvrLm3 suppresses cell-death triggered by several inducers of PTI and ETI. AvrLm3 is localized in plant apoplasm when expressed with its signal peptide, suggesting an extracellular localization. AvrLm3 potentially interacts with a secreted myrosinase-associated protein implicated in the myrosinase-glucosinolate system, suggesting that AvrLm3 could disturb glucosinolate production, which is a novel mode of action never described for a plant pathogen effector.My thesis allowed us to improve our knowledge on fungal effector function during infection and to propose new strategies for plant diseases managemen