Plant adaptation to N availability : The NLP7-dependent nitrate signalling pathway

L’azote est un des macronutriments essentiels pour les plantes. Dans les sols, l’azote est présent sous différentes formes organiques et inorganiques. Les plantes utilisent préférentiellement le nitrate, qui n’est pas toujours disponible en quantités suffisantes dans les sols. Récemment, une étude a permis de montrer que le facteur de transcription NLP7 est un régulateur majeur de la réponse primaire au nitrate. La localisation subcellulaire de cette protéine est régulée par le nitrate : en son absence, elle est localisée dans le cytoplasme alors qu’après ajout de nitrate, une rétention nucléaire est activée. Les mécanismes moléculaires de cette rétention restent encore à comprendre ainsi que la transmission du signal nitrate, de l’extérieur de la plante à la protéine NLP7. Le transporteur de nitrate NPF6.3 a été montré comme jouant un rôle dans la perception du nitrate, c’est donc un transcepteur. Notre hypothèse était que NPF6.3 est le récepteur de nitrate en amont de NLP7. Pour tester cette hypothèse, nous avons étudié par des approches génétiques les liens d’épistasie entre les deux gènes. L’étude de la biomasse et de l’expression des gènes sentinelles en réponse au nitrate chez les simples et double mutants a permis d’observer des phénotypes additifs. Nous avons pu montrer que le mécanisme de relocalisation rapide de la protéine NLP7 dans le noyau est toujours actif dans le fond mutant npf6.3. Ces résultats ont donc permis de montrer que NLP7 et NPF6.3 n’appartiennent pas à la même voie de signalisation mais que ces deux voies pourraient être dépendantes selon les conditions. D’autre part, peu de régulateurs de la réponse au nitrate sont connus. De manière intéressante, les gènes cibles de NLP7 sont enrichis en protéines régulatrices comme par exemple d’autres facteurs de transcription ou encore des protéines kinases, ce qui place NLP7 à un haut niveau hiérarchique de régulation dans la voie de signalisation en réponse au nitrate. En effet, ces cibles directes de NLP7 pourraient elles-mêmes être impliquées dans des voies de signalisation en aval de NLP7. Dans le but de disséquer la voie de signalisation en aval de NLP7, nous avons étudié deux cibles directes de NLP7, des Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinases (MAPKKKs), MAPKKK13 et MAPKKK14. Les MAPKs sont connues pour leur mode d’action en cascades de phosphorylations. Par des approches biochimiques en protoplastes, nous avons montré que MAPKKK13/14 sont capables d’activer des MAPKs du groupe C via MKK3. De plus, nous avons obtenu de premières indications montrant que certaines réponses développementales au nitrate ainsi que la réponse primaire au nitrate seraient partiellement modifiées dans les simples mutants mapkkk13 et mapkk14, et dans le double mutant mapkkk13/14.Nitrogen is one of the most important macronutrients for plants. In the soils, nitrogen can be found under different organic and inorganic forms. Plants preferentially use nitrate, which is not always available for plant uptake and assimilation in soils. Recently, it was shown that the NLP7 transcription factor is a master regulator of the primary nitrate response. Its subcellular protein localization is regulated by nitrate: without nitrate, the protein is localised in the cytoplasm whereas after nitrate resupply, a nuclear retention is observed. Molecular mechanisms of this nuclear-cytosolic shuttling and of the nitrate signal transduction from the external medium to the NLP7 protein are still unknown. It has been shown that the NPF6.3 nitrate transporter plays a role in the nitrate signal sensing, which made this protein a transceptor. Our hypothesis was that NPF6.3 is the nitrate sensor upstream of NLP7. To test this hypothesis, we studied by genetic approaches the epistasis link between the two genes. By studying the simple and double mutant’s biomass and sentinel gene regulation in response to nitrate, we observed additive phenotypes. We showed that the nuclear relocation mechanism of NLP7 is still active in the npf6.3 mutant background. All together, these results showed that NLP7 and NPF6.3 are not in the same signalling pathway but there would be an interplay depending on the conditions. On the other hand, only a few regulators of the nitrate response are known. Interestingly the direct target genes of NLP7 are highly enriched for regulatory proteins such as other transcription factors or protein kinases, which places NLP7 at a high hierarchical place in the nitrate signalling pathway. Indeed these direct targets of NLP7 may themselves be involved in signalling cascades downstream of NLP7. In order to identify molecular events downstream of NLP7, we studies two NLP7 direct targets, Mitogen-Activated Protein Kinase Kinase Kinases (MAPKKKs), MAPKKK13 and MAPKKK14. MAPKs are known to act as phosphorylation cascades. Using biochemical approaches in protoplasts, we have shown that MAPKKKK13/14 are able to activate Group C MAPKs via MKK3. In addition we showed in planta that nitrate addition indeed triggered the activation of group C MAPKs and that this activation is dependent on NLP7 and MKK3. Furthermore we obtained first indications that nitrate-dependent developmental traits and the primary nitrate response are partially impaired in the single mutants mapkkk13 and mapkkk14, and the double mutant mpkkk13mpkkk14