Study of Protein Complexes Associated with Homo- and with Hetero-dimer of G Protein Coupled Receptors

La mélatonine est une neuro-hormone secrétée par la glande pinéale pour réguler les rythmes circadiens, le sommeil, la physiologie de la rétine, la reproduction saisonnière et diverses fonctions neuronales. La mélatonine exerce ses fonctions en se liant à deux récepteurs membranaires appelés MT1 et MT2 qui appartiennent à la famille des récepteurs couplés aux protéines G (RCPG). Les RCPG sont connus pour former des homo- et hétérodimères mais la pertinence physiologique de ces complexes reste à démontrer. Plusieurs études montrent que la fonction de ces complexes ne se limite pas à la régulation des protéines G hétérotrimériques, mais inclue également la régulation d'autres protéines comme les transporteurs et les canaux ioniques. Dans ce travail, nous rapportons la formation d'hétérodimères MT1/MT2 dans les photorécepteurs de la rétine de souris et nous montrons que l’augmentation de la sensibilité de ces cellules à la lumière par la mélatonine requiert l'activation de la voie Gq/PLC/PKC qui est spécifique de l’hétéromère. Cette étude confirme alors la pertinence physiologique de l’hétérodimérisation des récepteurs de la mélatonine.Nous avons ensuite cherché à identifier de nouveaux partenaires de MT1 et MT2 en effectuant plusieurs cribles protéomiques et génétiques et un interactome de 378 protéines a pu être construit. L'analyse bioinformatique a révélé la présence de plusieurs protéines présynaptiques (canaux calciques voltage-dépendants Cav2.2, SNAP25, Synapsin et Munc-18) dans l'interactome MT1. Parmi ces partenaires, nous avons montré dans les cellules CHO que le récepteur MT1 interagit avec la protéine Cav2.2 et inhibe l’entrée du calcium d'une manière indépendante de la stimulation par l’agoniste, ce qui suggère un rôle régulateur de MT1 dans la libération des neurotransmetteurs.Un autre partenaire caractérisé est le transporteur de la dopamine DAT. L'interaction physique de DAT avec les récepteurs de la mélatonine diminue l’expression de DAT à la surface cellulaire et diminue l'absorption de la dopamine dans les cellules HEK293. La pertinence physiologique de ces observations a été appuyée par l’augmentation de la recapture de la dopamine dans les synaptosomes du striatum de souris knock-out pour les récepteurs de la mélatonine. En conclusion, ce rapport montre que la construction des interactomes des RCPG offre de nouvelles perspectives pour la découverte de nouvelles fonctions de ces récepteurs, comme les fonctions rétiniennes et neuronales des récepteurs de la mélatonine dans notre étude. La formation de complexes RCPG/RCPG, RCPG/canaux ioniques et RCPG/transporteurs peut avoir un effet fonctionnel réciproque au niveau de l’activité du récepteur et de ces partenaires, mettant ainsi en évidence de nouveaux mécanismes moléculaires de cross-talk cellulaire.Melatonin is a neurohormone secreated by the pineal gland in a circadian manner. This hormone is involved in the regulation of circadian rhythms, sleep, retinal physiology, seasonal reproduction and various neuronal functions. Melatonin exerts its effects through two G protein-coupled receptors (GPCR) called MT1 and MT2. GPCRs are known to form homo- and heterodimers, but the physiological relevance of these complexes remains a matter of debate. An increasing number of reports show that the function of these GPCR complexes is not restricted to the regulation of heterotrimeric G proteins but include also the regulation of other proteins like transporters and ion channels. Here, we report the formation of MT1/MT2 heterodimers in mouse retinal rod photoreceptors and show that the enhancing effect of melatonin on light sensitivity in these cells requires the activation of the heteromer-specific Gq/PLC/PKC signaling pathway. This study demonstrates the physiological relevance of GPCR heterodimerization.We next searched for new MT1 and MT2 interacting proteins in an unbiased manner by performing several proteomic and genetic screens. An interactome of 378 proteins was built. Bioinformatic analysis revealed the presence of several presynaptic proteins (voltage-gated calcium channel Cav2.2, SNAP25, Synapsin and Munc-18) in the MT1 interactome. Presynaptic localization of MT1 and spatial proximity with presynaptic proteins was confirmed in mouse and rat brains. Among these potential partners, we show that MT1 physically interacts with Cav2.2 in CHO cell line and inhibits Cav2.2-promoted Ca2+ entry in an agonist-independent manner suggesting a regulatory role of MT1 in neurotransmitter release.Another proteins identified in the screens was the dopamine transporter DAT. Physical interaction of DAT with melatonin receptors decreased DAT cell surface expression and diminished dopamine uptake in HEK293 cell. Supporting this result we found using the in vivo model of melatonin receptors knockout mice a respective increase of dopamine uptake in synaptosomal preparations of the striatum of supporting the physiological relevance of these GPCR/transporter complexes. In conclusion, this report shows that GPCR interactome building provides new insights into receptor function, like retinal and neuronal functions of melatonin receptors in our case. Formation of GPCR/GPCR, GPCR/ion channel and GPCR/transporter complexes may have a reciprocal functional impact, on the activity of the receptor and interacting partners thus elucidating new molecular mechanisms cellular cross-talk