Identification of novel physiopathological factors regulating the neutrophil NADPH oxidase : Importance of mTOR, elastase-mediated NOX2 degradation and prospects for treatment of liver cirrhosis-induced deficiencies

La production d’anion superoxyde (O2-) par le complexe NADPH oxydase 2 (NOX2) du polynucléaire neutrophile (explosion oxydative, EO) contribue à l’élimination d’agents pathogènes. Cette fonction de défense est stimulée par divers agents pro-inflammatoires, notamment par des peptides bactériens (fMLP), qui déclenchent une cascade de signalisation impliquant différentes protéines kinases (PKC, AKT, MAP-Kinases) et aboutissant à l’activation de la NOX2 (également nommée gp91phox), le coeur catalytique du complexe. Dans cette thèse, j’ai identifié la protéine kinase mTOR comme un nouvel effecteur majeur de l’EO dans les neutrophiles sains et j’ai comparé son mode d’action transductionnel dans les neutrophiles de patients ayant une cirrhose alcoolique décompensée en vue de comprendre leur grande susceptibilité aux infections bactériennes.Une contribution majeure de mTOR dans la production d’O2- induite par le fMLP a pu être démontrée à l’aide de son antagoniste spécifique, le médicament Rapamycine et par une approche antisense. mTOR agit en amont de la p38-MAPK qui phosphoryle la p47phox, un composant majeur du complexe NADPH oxydase. Dans les neutrophiles de patients cirrhotiques, l’EO est fortement défaillante, associée à un défaut d’activation de la voie p38-MAPK/p47phox(S345). Ce déficit d’EO est aggravé par la Rapamycine. Les neutrophiles de patients cirrhotiques présentent également un déficit d’expression de la gp91phox (NOX2), p22phox, p47phox et mTOR. Un déficit d’expression de la NOX2 a pu être reproduit en traitant les neutrophiles sains par le fMLP ou du plasma des patients. De plus, ce phénomène met en jeu une dégradation protéolytique insoupçonnée de la gp91phox impliquant l’élastase. Enfin, la déficience fonctionnelle des neutrophiles de patients a pu être corrigée dans des neutrophiles isolés et dans du sang total des patients cirrhotiques à l’aide d’un agoniste de récepteurs « Toll-like receptor (TLR) » qui agit en favorisant la transcription du gène de la gp91phox et sa synthèse protéique.En conclusion, mTOR émerge comme un nouvel effecteur transductionnel majeur de l’EO des neutrophiles, favorisant l’activation de la voie p47phox/gp91phox via les MAPK. Cette nouvelle voie de signalisation est fortement impactée au cours de la cirrhose alcoolique, ce qui favorise la susceptibilité des patients aux infections bactériennes. Bien que notre étude soulève ainsi des inquiétudes quant à l’utilisation d’inhibiteurs de mTOR chez les patients immunodéprimés, elle suscite par ailleurs la perspective de pouvoir corriger les déficits fonctionnels des neutrophiles à l’aide d’agents capables de stimuler des TLR intracellulaires.Superoxide anion (O2-) production by NADPH oxidase 2 (NOX2) complex of polymorphonuclear neutrophil (i.e respiratory burst, RB) contributes to efficient elimination of pathogens. This defense function is stimulated by various pro-inflammatory agents, especially by bacterial peptides (fMLP) which trigger a signaling cascade involving many protein kinases (PKC, AKT, MAP-Kinases) resulting in activation of NOX2, also called gp91phox, the catalytic core of the complex. In this thesis, I identified the protein kinase mTOR as a novel major RB effector of healthy neutrophils and I compared its transductional activity in neutrophils from patients suffering from alcoholic decompensated liver cirrhosis, aiming at understanding their high susceptibility to bacterial infections.A major contribution of mTOR to fMLP-induced neutrophil superoxide production was demonstrated using its specific drug antagonist Rapamycin, and by an antisens strategy. mTOR is activated upstream of p38-MAPK which phosphorylates p47phox, a major component of the NADPH oxidase complex. In neutrophils from cirrhotic patients, the RB is dramatically impaired and this was associated with a deficient activation of the p38-MAPK/p47phox(S345) signaling pathway. This RB deficiency was aggravated by Rapamycin. Neutrophils from cirrhotic patients also exhibited a deficient expression of gp91phox (NOX2), p22phox, p47phox and mTOR. A deficient NOX2 expression can be reproduced by treating healthy neutrophils with fMLP or plasma from cirrhotic patients. Furthermore, this phenomenon involved an unexpected proteolytic degradation of gp91phox mediated by elastase. Finally, this deficient superoxide production by neutrophil from cirrhotic patients can be corrected ex vivo in isolated neutrophils and in patients’ whole blood, using a Toll-like receptor agonist that acts by promoting the transcription and traduction of gp91phox .In conclusion, mTOR emerges as a novel and major signaling effector of neutrophil RB, promoting the activation of p47phox/gp91phox through MAPKs. This novel signaling pathway is strongly impaired during alcoholic liver cirrhosis, which increases patients’ susceptibility to bacterial infections. Although our study raises concerns about the use of mTOR inhibitors in immunocompromised patients, it also provides therapeutic propects for correcting neutrophil functional deficiencies using agents capable of stimulating intracellular TLR