Detection of enteric viruses in food matrices

Les principaux virus entériques à l’origine de toxi-infections alimentaires collectives (TIAC) sont les norovirus (NoV) et les virus d’hépatites (VHA et VHE) responsables respectivement de gastro-entérites et d’hépatites. Ces virus entériques sont transmis principalement par la voie féco-orale directe ou par ingestion d‘eaux ou d’aliments consommés crus ou peu cuits tels que les mollusques et les végétaux. La norme CEN/ISO 15216 propose des méthodes d’extraction et de détection par RT-qPCR pour les NoV et le VHA dans les végétaux, l'eau et les mollusques bivalves. Mais en cas de TIAC, divers aliments peuvent être suspectés et ces dernières années le VHE dont le potentiel zoonotique a été démontré est devenu un virus d’intérêt en hygiène alimentaire. Les travaux de thèse ont pour objectif le développement de méthodes de diagnostic viral dans le domaine alimentaire.Ces travaux ont permis de développer des méthodes pour la détection des NoV dans les produits laitiers et pour l’extraction du VHA à partir de tomates semi-séchées, aliments incriminés dans des épidémies d’hépatite A en Europe. De plus, le développement d’une méthode d’extraction et de détection du VHE par RT-PCR quantitative a permis d’estimer la prévalence du VHE dans les figatelli et les saucisses sèches de foie à environ 30%, confortant ainsi la possibilité d’une transmission du VHE à l’homme via ces aliments.Dans la norme CEN/ISO, la validation du diagnostic viral repose en partie sur l’ajout d’un virus contrôle de processus afin de mesurer l’efficacité de l’extraction virale. Des travaux ont montré que le choix du virus contrôle de processus était fonction de la matrice alimentaire analysée et du virus recherché.Dans le but de rechercher simultanément les NoV de génogroupe I et II et le virus contrôle de processus, une RT-qPCR multiplex a été développée pour les eaux de consommation et a montré une sensibilité similaire à la RT-qPCR en simplex. Récemment, la digital PCR (RT-dPCR) a été décrite comme une nouvelle approche de quantification absolue des génomes qui ne nécessite pas l’utilisation de gamme standard. L’évaluation des performances de quantification des génomes du VHE par RT-dPCR en microfluidique dans des matrices à base de foie naturellement contaminées a montré que la RT-dPCR permettait la quantification du VHE avec une sensibilité similaire par rapport à la RT-qPCR.En conclusion, ces travaux ont permis de contribuer à l’amélioration du diagnostic viral dans le domaine alimentaireThe main enteric viruses that cause foodborne outbreaks are noroviruses (NoV) and viruses of hepatitis (VHA and VHE) respectively responsible of gastroenteritis and hepatitis. These enteric viruses are mainly transmitted by the direct fecal-oral way or by the ingestion of water or raw or undercooked food such as shellfish and vegetables. The standard CEN/ISO 15216 proposes methods of extraction and detection by RT-qPCR for NoV and VHA in vegetable, water and shellfish. But in case of foodborne outbreaks, different foods can be suspected and these last years the VHE the zoonotic potential of which was demonstrated became a virus of interest in food hygiene. This thesis works aim to propose development of methods of viral diagnosis in the food domain.These works allowed to develop methods for the detection of the NoV in dairy products and for the extraction of the VHA from semi-dried tomatoes, food were incriminated in epidemics of hepatitis A in Europe. Furthermore, the development of a method of extraction and detection of the VHE by quantitative RT-PCR allowed to estimate prevalence of the VHE in figatelli and dried sausages of liver at approximately 30 %, so consolidating the possibility of a transmission of the VHE to the man via this food.One of the general requirements for detecting these viruses in food involves the use of a process control virus to monitor the quality of the entire viral extraction procedure as described in the standard CEN/ISO. Studies showed that the choice of virus depends on food type and the screened pathogenic virus.An one-step multiplex RT-qPCR assay was developed in bottled and tap water for the simultaneous detection of NoV GI, NoV GII and process control virus and showed a sensibility similar to the RT-qPCR simplex. Recently, digital PCR (RT-dPCR) has been described as a novel approach to genome quantification with no need for a standard curve. The performance of microfluidic RT-dPCR was compared to RT-qPCR when detecting HEV in pig liver products. The sensitivity of the RT-dPCR assay was similar to that of RT-qPCR.To summarize, this work has contributed to the improvement of the viral diagnosis in the food microbiolog