Role of DNA damage in cochlear cell degeneration : from molecular pathways to therapies

La presbyacousie est une perte de l'audition liée au vieillissement qui représente la troisième maladie chronique la plus répandue chez les personnes âgées. À ce jour, il est admis que le stress oxydant peut causer des dommages irréversibles à l'ADN et entraîner une sénescence prématurée dans les cellules en cycle. Cependant, il n'existe aucune donnée concernant le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires liée à l’âge. En plus le lien entre le stress oxydant, les dommages à l'ADN et le vieillissement des cellules cochléaires demeure obscure.Le premier objet de ce travail était d'élucider le rôle des dommages de l'ADN dans la dégénérescence des cellules cochléaires. Pour ce faire, nous avons utilisé des approches de biologie moléculaire et cellulaire pour identifier des voies de signalisation associées aux lésions de l'ADN dans des explants cochléaires issus de souris âgées de 3 jours traitées au cisplatine (CDDP), molécule connue pour son effet secondaire ototoxique. De plus, nous avons étudié l'implication de p53, un des effecteurs clés de la signalisation des dommages de l'ADN, in vivo en traitant avec le CDDP des souris dont le gène codant pour ce facteur de transcription a été invalidé. Les possibilités de protéger l’audition contre l’effet nocif du CDDP ont été également étudiées en utilisant des inhibiteurs spécifiques ciblant les étapes clés des voies de signalisation. Enfin, nous avons utilisé des modèles murins porteurs de xénogreffes de cancer du sein humain afin de vérifier si les co-traitements permettaient de préserver l’audition sans compromettre l’efficacité anti-tumorale du CDDP. Nos résultats montrent que le CDDP induit des cassures doubles brins de l'ADN dans les cellules ciliées qui sont à l'origine de l'activation de la voie ATM-Chk2-p53 et, in fine, de la mort de ces cellules par apoptose. Nous avons également montré que l'absence de p53 in vivo prévient la perte de l'audition et la dégénérescence des cellules ciliées externes après injection intrapéritonéale de CDDP. L’application systémique ou locale de PFT-α, un inhibiteur de p53 prévient efficacement la perte auditive sans compromettre l’efficacité anti tumorale du CDDP.Le deuxième objectif de ma thèse a reposé sur l’identification des liens existant entre la surproduction des espèces réactives de l'oxygène (ROS), les dommages de l’ADN et l’apparition précoce des marqueurs de la sénescence cellulaire et de la perte de l’audition liée à l’âge. Pour ce faire, j’ai utilisé des explants cochléaires de souris âgées de 3 jours traitées au peroxyde hydrogène (H2O2). L’apparition des dommages à l’ADN et des cellules en sénescence a été étudiée en utilisant des techniques d’immunomarquage et de Western blot. Les résultats ainsi obtenus in vitro ont été ensuite validés in vivo sur les cochlées provenant de souris SAMP8 et de souris SAMR1. Afin de confirmer le rôle du stress oxydant dans l’apparition précoce de la presbyacousie, nous avons utilisé une lignée de souris invalidées pour le gène P66Shc, qui est un gène d'adaptation au stress connu pour ses rôles dans la surproduction de ROS et dans l’inhibition des enzymes antioxydants. Enfin, nous avons évalué la possibilité de prévenir ou de ralentir la perte de l’audition liée à l’âge en traitant les souris SAMP8 avec un mimétique de SOD/catalase, le EUK207. Nos résultats ont montré que: i) la surproduction de ROS est l'un des principaux facteurs causaux de la dégénérescence des cellules sensorielles de la cochlée liée à l’âge ; ii) L’activation de la voie p53-p21 entraînant l’apparition précoce de la sénescence dans les cellules cochléaires post-mitotiques, peut expliquer le vieillissement prématuré de la cochlée; iii) Le EUK207, un piégeur du superoxyde et du peroxyde d'hydrogène peut atténuer la ARHL chez les souris SAMP8. L’ensemble de ces résultats mettent en évidence des stratégies novatrices et efficaces pour la protection de l'audition.Presbycusis or age-related hearing loss is the third most common chronic disease. It represents a major health issue in our modern society. This is due to its evolving feature and the invalidating character of this disease. To date, it is generally accepted that oxidative stress can cause irreversible DNA damage and lead to premature senescence in cycling cells. However, there is no data on the role of DNA damage in age-related cochlear cell degeneration. Moreover, the link between oxidative stress, DNA damage and cochlear cell aging remains unclear.The main objective of this work was therefore to elucidate the role of DNA damage in the degeneration of cochlear cells. To do this, we used molecular and cellular biology approaches to identify signaling pathways associated with DNA damage in cochlear explants from 3-days old mice treated with cisplatin (CDDP). This antineoplastic drug is cytotoxic by causing DNA damage and is known for its harmful effects on hearing. In addition, we investigated the involvement of p53, one of the key effectors of DNA damage signaling, in vivo by treating p53ko mice with cisplatin. Using specific inhibitors targeting key steps of signaling pathways, hearing protection from the harmful effect of CDDP have also been studied. Finally, we used mouse models carrying xenografts of human breast cancer to check whether the co-treatments we had implemented made it possible to preserve the hearing without compromising the anti-tumor efficacy of the CDDP. Our results show that CDDP induces DNA double-strand breaks in the hair cells that are responsible for the activation of the ATM-Chk2-p53 pathway and, ultimately, for the death of these cells by apoptosis. . We have also shown that the absence of p53 in vivo prevents hearing loss and external hair cells degeneration upon intraperitoneal injection of CDDP. The systemic or local treatment using the p53 inhibitor PFT-α effectively prevents hearing loss without compromising the anti-tumor efficacy of CDDP.The second objective of my thesis was to identify the links between the overproduction of reactive oxygen species (ROS), DNA damage, markers of cell senescence and age-related hearing loss. To do this, I used cochlear explants of 3-days old mice treated with increasing concentrations of hydrogen peroxide (H2O2). The appearance of DNA damage and senescent cells was investigated using immunolabeling and Western blotting technics. The results obtained in vitro were then validated in vivo on cochleae from SAMP8 (Senescence Accelerated Mouse Prone 8) and SAMR1 (Senescence Accelerated Mouse Resistant 1) mice. In order to confirm the role of oxidative stress in the early onset of presbycusis, we used a mouse line invalidated for the P66Shc gene, which is a stress adaptation gene known for its roles in ROS overproduction and in the inhibition of antioxidant enzymes. Finally, we assessed the possibility of preventing or slowing-down age-related hearing loss by treating SAMP8 mice with a SOD/catalase mimetic; EUK207. Our results showed that: i) overproduction of ROS is one of the major causal factors of age-related cochlear sensorial cells degeneration; ii) Activation of the p53-p21 pathway resulting in the early onset of senescence in postmitotic cochlear cells may explain premature aging of the cochlea; iii) EUK207 which is a superoxide and hydrogen peroxide scavenger, can attenuate ARHL in SAMP8 mice.All together our results highlight innovative and effective strategies for hearing protection