Search for potential partners of Damaged-DNA Binding 2 protein in the regulation of gene expression : the case of heterogeneous ribonucleoprotein K and J in the regulation of NFKBIA gene

Le laboratoire a identifié récemment la protéine DDB2 comme ayant une activité dans la régulation de l’expression de gènes cibles tels que SOD2, BCL2 et NFKBIA, conférant ainsi à cette protéine un rôle dans le contrôle de la progression métastatique et dans la réponse thérapeutique des cellules tumorales mammaires. Cependant, l’activité réelle de DDB2 dans la transcription génique reste à définir, car sa structure ne permet pas d’expliquer son influence sur l’expression de ses gènes cibles. Cette activité peut être soit inhibitrice comme pour SOD2 et BCL2, soit activatrice comme NFKBIA qui code la protéine IκBα, suggérant que DDB2 doit s’associer avec des inhibiteurs ou des activateurs de la transcription génique, ou en favoriser le recrutement. Afin d’identifier ces partenaires potentiels, susceptibles de participer à son activité transcriptionnelle, nous avons développé une approche de « DNA pull-down », couplée à une analyse protéomique globale par spectrométrie de masse à partir des cellules tumorales mammaires MCF-7 surexprimant naturellement DDB2. Nous avons révélé la présence du complexe UV-DDB (DDB2, DDB1 et Cul4A) sur le promoteur des gènes SOD2 et NFKBIA. Nous avons également mis en évidence que ce complexe, connu pour participer aux premières étapes de la réparation de l’ADN lésé par des rayonnements UV, favorise le recrutement de l’histone acétyl transférase p300 sur le promoteur du gène NFKBIA, expliquant en partie le rôle activateur de DDB2 sur ce gène cible. Notre analyse protéomique à révéler, avec un score élevé, la présence des protéines hnRNP K et J sur le promoteur du gène NFKBIA et d’une manière indépendante de toute interaction physique avec DDB2. La forme J, très peu décrite, présente une affinité plus grande pour le promoteur du gène NFKBIA que la forme K. De plus, nous l’avons observée strictement nucléaire et liée à la chromatine. De manière intéressante, nous montrons que la forme J est surexprimée dans le noyau des cellules tumorales MDA-MB231 métastatiques, comparativement aux cellules T47D non métastatiques. Par la suite, nous avons évalué l’importance des hnRNP K et J dans la transcription du gène NFKBIA par rapport à DDB2 et un régulateur bien décrit tel que le facteur de transcription Sp1. Nos résultats indiquent que les protéines hnRNP K et J, lorsqu’elles sont surexprimées, jouent un rôle de répresseur du gène NFKBIA et ce même en présence des activateurs DDB2 et Sp1. L’ensemble de ce travail a contribué à montrer la présence de protéines, pouvant participer à l’activité transcriptionnelle de DDB2, telles que le complexe UV-DDB et p300. En dehors de tout partenariat avec DDB2, il a été mis en évidence une relation entre les hnRNP K et J et l’activité constitutive de NF-κB, en particulier avec la forme J, qui, par son expression corrélée à l’agressivité des cellules tumorales mammaires, présente un intérêt clinique potentiel en tant que marqueur prédictif de la progression métastatique, tout comme DDB2The laboratory has recently identified the DDB2 (Damaged-DNA Binding 2) protein as a regulator of target gene expression like SOD2, BCL2 and NFKBIA, thus conferring to this protein a role in control of metastatic progression and therapeutic response of breast cancer cells. However, the real activity of DDB2 in gene transcription remains to be defined because its structure cannot entirely explain its influence on target gene expression. This protein can act either as an inhibitor like for the SOD2 and BCL2 genes or as an enhancer like for the NFKBIA gene, encoding IκBα protein. This suggests that DDB2 must associate with, or promote recruitment, of inhibitors or activators of gene transcription. In order to search and identify potential partners that could participate in its transcriptional activity, we developed a “DNA pull-down” approach associated with a global proteomic analysis by mass spectrometry from MCF-7 breast cancer cells overexpressing naturally DDB2. With this approach, we reveal the presence of the UV-DDB complex composed by DDB2, DDB1 and Cullin 4A proteins on the SOD2 and NFKBIA gene promoters. We also highlighted that this complex, known for its role in first steps of UV-induced DNA lesion repair, promotes the recruitment of the p300 histone acetyl transferase on the NFKBIA gene promoter, which may explain, in part, the enhancer activity of DDB2 on this target gene. The proteomic analysis from the “DNA pull-down” also reveals, with originality, the presence of heterogeneous ribonucleoproteins K and J (hnRNP K and J) on the NFKBIA gene promoter with a high recovery score among many other proteins and independently of any physical interaction with DDB2. The J form, very poorly described, shows a higher affinity for NFKBIA gene promoter than the K form. Furthermore, we observed that the J form is strictly nuclear and mostly bound to chromatin, while the K form is also found in cytoplasm. Interestingly, we show that the J form is overexpressed in nucleus of metastatic breast cancer MDA-MB231 cells by comparison with non-metastatic breast cancer T47D cells. Then, we evaluated the importance of hnRNP K and J proteins in NFKBIA gene transcription compared with DDB2 and with a well-known regulator, the Sp1 transcription factor. Our results show that hnRNP K and J proteins, when they are overexpressed, play a repressor role on NFKBIA gene expression by binding on its promoter even in presence of DDB2 and Sp1 activators. Taken together, these data show that some proteins could participate in DDB2 transcriptional activity, like the UV-DDB complex and the p300 protein. Outside of any interaction with DDB2, this work highlights a relationship between the hnRNP K and J proteins, and NF-κB constitutive activity, especially with the J form. This latter has an expression correlated with aggressiveness of breast cancer cells and a potential clinical interest as a predictive marker of metastatic progression, like DDB