Toxicogenomic study of mesoporous silica nanocarriers : relationship between surface decoration and toxicity

Les nanoparticules (NPs) concentrent beaucoup d’espoir en nanomédecine, en particulier les nanoparticules magnétiques de silice mésoporeuse (M-MSN) qui pourraient permettre des avancées en théranostic. Néanmoins l’innocuité de ces NPs recouvertes de décorations leur conférant des propriétés spécifiques, doit être démontrée afin d’éviter des effets néfastes sur les tissus sains, notamment sur le foie, l’organe de transformation des xénobiotiques. L’objectif de cette thèse était donc d’évaluer la toxicité potentielle de M-MSN soit natives, soit recouvertes de polyéthylène glycol (PEG), soit entourées d’une bicouche lipidique de 1,2-Dimyristoyl-sn-glycero-3-phosphocholine (DMPC). Pour ce faire un modèle de cellules humaines hépatiques (HepaRG) a été choisi pour effectuer des tests de toxicité in vitro et pour élucider le mode d’action intracellulaire de ces différentes NPs.Les caractéristiques physico-chimiques des M-MSNs natives et décorées ont été mesurées par différentes techniques comme la diffusion dynamique de la lumière (DLS), la microscopie électronique à transmission (TEM) et la microscopie à force atomique (AFM). La toxicité des NPs a été évaluée tout d’abord par des tests de viabilité et par impédance cellulaire en temps réel (xCELLigence).L’étude des profils d’expression génique sur des oligo microarrays à très haute densité (8x60k sondes, Agilent) a ensuite permis d’évaluer, de façon dose- et temps-dépendante, la toxicité de ces NPs. De plus l’utilisation d’une méthodologie originale d’analyse comparative de données massives nous a permis de mettre en évidence les mécanismes moléculaires déclenchés par les NPs dans les hépatocytes. Nous avons déterminé des doses n’induisant aucune toxicité ou une légère toxicité transitoire après 24h, soit une valeur seuil de biocompatibilité avec les cellules HepaRG. Nous avons également montré par TEM le ralentissement de l’internalisation des NPs lorsqu’elles sont PEGylées ainsi que leurs effets transcriptomiques différés par rapport aux NPs natives et lipidiques. Néanmoins, une dose de 80 µg/cm² de M-MSNs, natives ou décorées, déclenche l’enchaînement des évènements de l’AOP (Adverse Outcome Pathway) de la cholestase hépatique. Ce résultat démontre que cette méthodologie est adaptée à la toxicologie prédictive par analyse des réponses biologiques cellulaires après exposition à des substances exogènes.Par ailleurs, les NPs ont tendance à se recouvrir de protéines (corona) en présence de sérum humain. L’analyse par impédance cellulaire montre que des M-MSNs entourées d’une corona de protéines sériques humaines ou bovines ne provoquent pas la même toxicité sur des cellules humaines. Ce résultat pose la problématique d'une potentielle surestimation de la toxicité des nanoparticules lors d’essais in vitro, utilisant classiquement du sérum de veau dans les milieux de cultures.Nous avons entrepris l’étude de la dynamique de la corona (entre 30s et 7 jours) par spectrométrie de masse en tandem. Cette analyse a mis en lumière trois types de comportements protéiques. Le premier cluster contient des protéines abondantes qui se désorbent au cours du temps, le second cluster est composé de protéines qui s’enrichissent progressivement et issues de mêmes familles protéiques comme les apolipoprotéines, et le troisième cluster contient des protéines à enrichissement tardif dans la corona, attirées par leur affinité pour des protéines déjà présentes. Un réseau dynamique d’interactions protéines-protéines, ou intéractome, a pu être cartographié au sein de la corona. Ces travaux posent les bases d’un possible contrôle des protéines de la corona afin de conférer aux nanovecteurs des propriétés de furtivité leur permettant d’atteindre des organes cibles sans être opsonisés. Les techniques utilisées au cours de ce travail, basées sur les analyses de quantités massives de données biologiques, pourraient faire partie de futurs standards d’évaluation de la nanosécurité.Nanoparticles (NPs) capable of transporting and releasing therapeutic agents to target tissues constitute one of the most exciting areas in nanomedicine, especially magnetic mesoporous silica nanoparticles (M-MSN). M-MSNs may be addressed to tumors thanks to their magnetism and can act as drug carriers thanks to their high specific surface area. Nevertheless, the safety of these NPs with decorations, conferring them specific properties, must be assessed in order to avoid harmful effects on healthy tissues, in particular on the liver, the organ of xenobiotics metabolism.The goal of this thesis was therefore to evaluate the potential toxicity of M-MSN either pristine, or coated with polyethylene glycol (PEG), or surrounded by a lipid bilayer of 1,2-dimyristoyl-sn-glycero-3- Phosphocholine (DMPC). To this end, the human hepatic cell model HepaRG was chosen to realize in vitro toxicity testing and to elucidate the intracellular mode of action of these various NPs.The physico-chemical properties of pristine and covered M-MSNs were measured using different techniques such as dynamic light scattering (DLS), transmission electron microscopy (TEM) and atomic force microscopy (AFM). NPs toxicity was first evaluated by viability testing and real-time cell impedance analysis (xCELLigence).Gene expression profiles were then performed through very high density oligo microarrays (8x60k, Agilent) to evaluate, in a dose- and time-dependent manner, the toxicity of these NPs. In addition, the use of an original methodology for comparative analysis of large biological data allowed us to demonstrate the molecular mechanisms triggered by the NPs in the hepatocytes. We were able to determine the dose not triggering any toxicity as well as the dose inducing a slight transient toxicity after 24h. We thus defined this latter value as a threshold of biocompatibility with HepaRG cells. We also showed by TEM a slower uptake of PEGylated NPs by cells as well as their delayed effects on the transcriptome compared to the pristine and DMPC NPs. Nevertheless, a dose of 80 μg/cm² of pristine or covered M-MSNs triggers the chain of events of the hepatic cholestasis AOP (Adverse Outcome Pathway). This result demonstrates that this methodology is suitable for predictive toxicology by analysis of cellular biological responses after exposure to exogenous substances.Furthermore, NPs tend to be covered with proteins in the presence of serum (corona). Cell impedance analysis shows that M-MSNs surrounded by human or bovine serum proteins coronas do not trigger the same toxicity on human cells. This result raises the problem of a potential overestimation of NPs toxicity to human cells in in vitro testing by using fetal bovine serum in culture media.We undertook a dynamic analysis (between 30 s and 7 days) of the corona formation by tandem mass spectrometry has highlighted three groups of protein with distinct behaviors. The first cluster contains some abundant proteins that desorb over time, the second cluster comprises some protein families such as apolipoproteins, and the third cluster contains late enrichment proteins attracted by other proteins already present in the corona. A dynamic network of protein-protein interactions inside the corona, namely the interactome, was built from the data. This work opens the way to a possible control of the corona in order to provide the nanocarriers with stealth properties allowing them to reach target organs without being opsonized.These techniques used during this thesis and based on analyses of biological big data might be part of the future standards on nanosafety evaluation