Mélanocytes et synthèse de mélanine, voies privilégiées pour activer la synthèse

La première partie de la thèse était de définir et de valider une méthode d'extraction de cellules épidermiques la plus simple, la plus efficace et la plus applicable à des petits échantillons, et évitant les réactifs animaux. Dans cette étude, TrypLPM, une enzyme de dissociation cellulaire exempte d'origine animale, a remplacé la dispase et la trypsine comme enzyme destinée à l'extraction des mélanocytes. Ce produit pourrait simplifier le protocole d'extraction, éliminer les contaminants pathogènes potentiels de l'animal et diminuer la contamination par les kératinocytes pendant l'extraction et la culture des mélanocytes. L'efficacité d'extraction a été jugée sur les critères suivants: séparation épiderme / derme, fonctionnalité des mélanocytes extraits (prolifération, synthèse de la mélanine).La deuxième partie de la thèse était d'explorer l'interaction entre l'épiderme et le derme dans l'hyperpigmentation, en se focalisant sur la protéine Dickkopf 1 (Dkkl) qui est sécrétée par le fibroblaste dermique et codée par le gène Dkkl. Dkkl est un inhibiteur de la voie de signalisation Wnt, qui en isolant le co-récepteur LRP5 / 6, empêche la formation du complexe Frizzeled-Wnt­LRP5 / 6. Nous avons émis l'hypothèse que TGF-β1 participe au développement du lentigo solaire en réduisant l'expression de Dkkl dans les fibroblastes par la voie p38 MAP kinase, ce qui conduit à une activation de la cascade de signalisation Wnt / β-caténine. Cette hypothèse a été confirmée dans le modèle cellulaire 2D de fibroblastes issus de lentigo et de peau normale adjacente, et également dans le modèle de peau 3D irradiée aux UV, en étudiant l'expression génique et la sécrétion protéique de Dkk 1.The first part of the thesis was to define and validate an epidermal cell extraction method being the simplest, the most effective and applicable to smaller samples and avoiding animal reagents. In this study, TrypLE™, an animal origin-free cell dissociation enzyme, replaced dispase and trypsin as dissociated enzyme for melanocytes extraction. This product could simplify extraction protocol, eliminate potential pathogenic contaminants from animal and decrease keratinocytes contamination during extraction and subculture of melanocytes. The extraction efficiency was judged on the following criteria: separation epidermis / dermis, functionality of the extracted melanocytes (proliferation, melanin synthesis).The second part of the thesis was to explore the role of cross-talking between epidermis and dermis in hyperpigmentation, focused on Dickkopf-related protein l(Dkkl) which is secreted by dermal fibroblast and encoded by Dkkl gene is an antagonistic inhibitor of the Wnt signaling pathway, by isolating the LRP5/6 co-receptor and preventing the Frizzeled-Wnt-LRP5/6 complex formation. We hypothesized that TGF-βl mediates development of solar lentigo by reducing Dkkl expression in fibroblasts through the p38 MAP kinase pathway, which leads to an activation of the Wnt/ β-catenin signaling cascade. This hypothesis was confirmed in the fibroblast of lentigo and adjacent normal skin, also in the UV A-irradiation 3D skin mode! by testing of Dkkl secretion in protein level and Dkkl expression in RNA level