Structural insight into photobleaching mechanisms of reversible photoswitchable fluorescent proteins

La découverte des Protéines Fluorescentes Phototransformables (PTFPs) issuesd’espèces anthozoaires a ouvert, grâce à leurs propriétés photophysiques particulières, unvaste champ d’investigation pour l'imagerie biologique de fluorescence. L'un des sousgroupesdes PTFPs est formé des protéines fluorescentes réversiblement photocommutables(RSFPs), qui peuvent être commutées réversiblement entre des états non-fluorescent etfluorescent. Le photoblanchiment est la perte définitive d’émission de fluorescence sousexcitation et est un phénomène commun à toutes les molécules fluorescentes. Lephotoblanchiment a un impact important sur la qualité des images de microscopie, notammenten imagerie de super-résolution. Les RSFPs ont tendance à perdre de leur performance àchaque cycle de commutation, un processus dénommé “photofatigue”. Notre intérêt est centrésur l'étude des mécanismes de photofatigue des RSFPs.Nous avons rapporté les structures cristallographiques d’IrisFP photoblanchie par uneforte et une basse intensité d’illumination à température ambiante ainsi que les modificationsspectroscopiques associées. Nos résultats démontrent que différentes intensités d'excitationpeuvent donner lieu à différentes voies de photoblanchiment. Sous faible intensité d'excitation,une voie de photoblanchiment dépendante de l'oxygène a été mise en évidence. Lesmodifications structurales induites par la production d'oxygène singulet à l'intérieur de lapoche du chromophore ont révélé l'oxydation de deux résidus soufrés, Met159 et Cys171,piégeant le chromophore dans un état protoné non-fluorescent. Sous haute intensitéd'excitation, une voie de photoblanchiment oxygène-indépendante totalement différente a ététrouvée. Le Glu212, strictement conservé, subit une décarboxylation associée à un importantréarrangement du réseau de liaisons hydrogènes autour du chromophore, et un changementd’hybridation sp2 vers sp3 du carbone reliant les cycles du chromophore est observé. En tantque résidu clé impliqué dans le photoblanchiment induit par faible intensité d'excitation, nousavons muté Met159 en alanine afin d'éviter une sulfoxydation. Nous avons trouvé que lemutant IrisFP-M159A démontre une photostabilité améliorée en solution, en gel PVA et dansdes cellules E. coli.The discovery of phototransformable FPs (PTFPs) from Anthozoa species, thanks totheir photophysical properties, has opened a large field in biological fluorescence imaging.One of the PTFPs’ sub-groups consists of Reversible Photoswitchable Fluorescent Proteins(RSFPs), which can be reversibly switched between nonfluorescent and fluorescent states.Photobleaching is the permanent loss of the fluorescence-emitting capacity under excitation,which is a common phenomenon among all the fluorescent molecules. Photobleaching has alarge impact on the microscopy image quality, notably on super-resolution imaging.Photoswitchable fluorescent proteins have a tendency to lose performance within everyswitching cycle, a process referred to as “photofatigue”. Our interest of study is focused onthe photobleaching mechanisms of RSFPs.We have reported the crystallographic structure of photobleached IrisFP under highand low illumination intensity at room temperature as well as its spectroscopic modifications.We found that different illumination intensities can result in different photobleachingpathways. Under low illumination intensity, an oxygen-dependent photobleaching pathwaywas evidenced. Structural modifications induced by singlet-oxygen production within thechromophore pocket revealed the oxidation of two sulfur-containing residues, Met159 andCys171, locking the chromophore in a nonfluorescent protonated state. Under highillumination intensity, a completely different, oxygen-independent photobleaching pathwaywas found. The conserved Glu212 underwent decarboxylation concomitantly with anextensive rearrangement of the H-bond network around the chromophore, and an sp2-to-sp3hybridization change of the carbon atom bridging the chromophore cyclic moieties wasobserved. As Met159 is the key residue involved in low-intensity illumination photobleaching,we have then mutated Met159 into Alanine in order to avoid sulfoxidation. We found that theIrisFP-M159A mutant display an enhanced photostability in solution, in PVA gel and inE.coli cells