Structural studies of Nucleosome Assembly

Au sein du noyau, l'ADN est organise en chromatine dont l'unité de base est le nucléosome. La structure de la chromatine est très dynamique, ce qui est nécessaire pour la plupart des opérations qui se produisent dans l'ADN telles que la réplication, la transcription, la réparation et la recombinaison. Le nucléosome est constitué de deux dimères H2A/H2B et deux dimères H3/H4 associés avec 147 paires de bases d'ADN. La protéine Nap1 est un chaperon d'histone H2A/H2B impliquée dans l'assemblage et démontage des nucléosomes. Nap1 protège les interactions non spécifiques entre l'ADN chargé négativement et les dimères H2A/H2B chargés positivement, afin de permettre la formation de la structure ordonnée des nucléosomes. Lors de l'assemblage des nucléosomes, les dimères d'histones H3/H4 sont déposés en premier lieu, suivi par le dépôt de dimères H2A/H2B. Lors du démontage du nucléosome, les dimères H2A/H2B sont retirés avant le retrait des dimères H3/H4. La determination de la structure du complexe Nap1-H2A/H2B pourra permettre une meilleure compréhension du processus d'assemblage du nucléosome. Dans cette étude, nous voulons comprendre comment le chaperon Nap1 cible spécifiquement les dimères d'histones H2A/H2B pour l'assemblage des nucléosomes. Notre objectif est de caractériser la structure et la fonction du complexe de Nap1-H2A/H2B. Ainsi nous nous sommes tout d'abord intéresse à la stoechiometrie de ce complexe. Nous avons trouvé qu'un dimère de Nap1 s'associe à un dimère H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). D'autre part, l'analyse par spectrométrie de masse non-dénaturante a montré que ce complexe de base peut s'oligomériser et contenir jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. L'analyse de ce complexe par spectrométrie de masse non-dénaturant a montré que ce complexe peu oligomériser dans un grand complexe contenant jusqu'à 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Nous avons également obtenu la première structure cristalline à basse résolution de ce complexe. L'analyse du même complexe par microscopie électronique à coloration négative a révélé la présence en solution du même oligomère que dans l'unité asymétrique du cristal, qui contient aussi 6 copies de Nap1_2-H2A/H2B. Ainsi, nous avons pu mettre en évidence de nouvelles interfaces d'interaction entre les différents composants de ce complexe qui nous permettent de mieux comprendre le processus d'assemblage des nucléosomes. Le remodelage de la chromatine permet l'expression des gènes eucaryotes. Ce remodelage nécessite des enzymes telles que des histone acétyltransférases (HAT) et les chaperons d'histones. Les HATs acétylent les chaînes latérales des lysines. Il a été proposé que les HATs et les histones chaperons agissent en synergie pour moduler la structure de la chromatine pendant la transcription. La HAT p300 a été proposé d'interagir avec l'histone chaperon Nap1. Nous avons entrepris de caractériser cette interaction. Malheureusement, nos expériences n'ont pas pu détecter d'interaction directe entre ces protéines.Assembly of chromatin is an essential process that concerns most DNA transactions in eukaryotic cells. The basic repeating unit of chromatin are nucleosomes, macromolecular complexes that consist of a histone octamer that organizes 147 bp of DNA in two superhelical turns. Although, the structures of nucleosomes are known in detail, their assembly is poorly understood. In vivo, nucleosome assembly is orchestrated by ATP-dependent remodelling enzymes, histone-modifying enzymes and a number of at least partially redundant histone chaperones. Histone chaperons are a structurally diverse class of proteins that direct the productive assembly and disassembly of nucleosomes by facilitating histone deposition and exchange. The currently accepted model is that nucleosome assembly is a sequential process that begins with the interaction of H3/H4 with DNA to form a (H3/H4)2 tetramer-DNA complex. The addition of two H2A/H2B dimers completes a canonical nucleosome. High-resolution structures of histone chaperons in complex with H3/H4 histones have resulted in detailed insights into the process of nucleosome assembly. However, our understanding of the mechanism of nucleosome assembly has been hampered by the as yet limited number of co-crystal structures of histone–chaperone complexes. In particular it remains unclear how histone chaperons mediate H2A/H2B deposition to complete nucleosome assembly. In this work, we have investigated the role of the H2A/H2B chaperon Nap1 (Nucleosome assembly protein 1) in nucleosome assembly. We have determined the crystal structure of the complex between Nap1 and H2A/H2B and analysed the assembly by various biophysical methods. The structure shows that a Nap1 dimer binds to one copy of H2A/H2B (Nap1_2-H2A/H2B). A large ~550 kDa macromolecular assembly containing 6 copies of the Nap12-H2A/H2B complex is seen in the asymmetric crystallographic unit. We confirmed by both non-denaturing mass spectroscopy and negative stain electron microscopy studies that this assembly is the predominant form of the Nap1_2-H2A/H2B complex in solution. We further investigated the potential interplay between p300-mediated histone acetylation and nucleosome assembly. Together, the structure and associated functional analysis provide a detailed mechanism for the Nap1 chaperon activity, its role in H2A/H2B deposition and in nucleosome assembly