Research of ATAD3 partners and study of the effect of invalidation on the adipocyte differentiation.

Le projet principal a consisté à étudier le rôle d'ATAD3 dans un modèle de différenciation cellulaire en culture, les cellules adipocytaires 3T3-L1 induites par l'insuline. L'induction de ces cellules provoque la mise en route du programme d'adipogenèse qui précède la synthèse de gouttelettes de triglycérides (lipogenèse). Nous avons observé qu'au cours de la différenciation, une synthèse et un remodelage du réseau mitochondrial ont lieu. ATAD3, exprimée dans les pré-adipocytes, s'accumule avant la synthèse et le remodelage du réseau mitochondrial et est maintenue élevée tout au long de la différenciation. Nous avons réalisé des lignées invalidées constitutivement pour ATAD3 (siRNA) et étudié la différenciation de ces cellules. Nous avons montré que l'invalidation d'ATAD3 inhibe la lipogenèse et le remodelage du réseau mitochondrial sans affecter la signalisation par l'insuline ni la synthèse des protéines mitochondriales. Le phénotype a été récupéré par transfection d'ATAD3 et une complémentation par Drp1 a été mise en évidence. Ces résultats montrent qu'ATAD3 est nécessaire et limitant dans la différenciation adipocytaire. Trois projets annexes ont complétés ce travail de thèse : Le premier a consisté à contribuer à la purification d'ATAD3 humaine, produite chez la levure. Ces expériences n'ont pas permis de révéler l'activité ATPasique d'ATAD3 mais ont permis d'obtenir une quantité significative de protéine recombinante qui pourra servir à la production d'anticorps ainsi qu'à d'autres applications. Le second a consisté à étudier les isoformes d'ATAD3 chez l'homme et les rongeurs. Ces expériences ont permis de révéler l'existence de plusieurs isoformes tissulaires. Un troisième projet a consisté à identifier des partenaires protéiques d'ATAD3 afin de tenter de comprendre la fonction de cette protéine. A l'aide de sondes protéiques d'ATAD3 radiomarquées (transcription/traduction in vitro), nous avons réalisé des tests d'interaction de type Far Western. Ces expériences ont aboutis à quelques candidats potentiels interagissant avec les parties N- ou C-terminale d'ATAD3.ATAD3 is a vital inner membrane mitochondrial ATPase with unknown function but widely expressed in animals and plants. The main project was to study the role of ATAD3 in a cellular model of differentiation, the one used being adipocyte-like 3T3-L1 cells induced by insuline. Induction of these cells provokes the start of the adipogenesis program which precedes lipid droplets synthesis (lipogenesis). We observed that along differentiation, a synthesis and a remodelling of mitochondria occur. ATAD3, which is expressed in pre-adipocytes, is increased before lipid droplets accumulation and before mitochondrial synthesis and remodelling and is maintained all along differntiation. We have generated cell lines with constitutive invalidation of ATAD3 (siRNA) and studied the differentiation of these cells. We have shown that ATAD3 invalidation inhibits lipogenesis and mitochondrial remodelling without any inhibition of insulin transduction signal neither inhibition of mitochondrial protein synthesis. The phenotype was rescued by ATAD3 transfection and complemented by over-expression of Drp1. These results show that ATAD3 is a necessary and limiting factor in adypocyte differentiation and lipogenesis. Three parallel projects completed this thesis work: The first was to contribute to purification of recombinant human ATAD3 produced in yeast. These experiments didn't allow us to reveal the ATPase activity of ATAD3 but allowed us to obtain a significant quantity of purified protein that will be useful to generate antibodies and also for others applications. The second was to study ATAD3 isoforms expression profiles in human and rodent samples. These experiments allowed the description of several isoforms of ATAD3 with tissue-specific expression. A third project was the identification of ATAD3 protein partners in order to try to understand its function. Using labelled ATAD3 protein probes (in vitro transcription/traduction), we performed interaction tests by Far Western. These experiments led to the identification of sev