Characterization of the vacuolar proteome of the model plant Arabidopsis thaliana and studies of its role in cadmium detoxification

Afin de mieux comprendre les mécanismes du trafic cellulaire, les processus de transport des substrats vacuolaires à travers le tonoplaste, le stockage des métabolites et leur dégradation, une analyse globale et exhaustive du protéome vacuolaire d'Arabidopsis thaliana a été réalisée. La connaissance de la localisation subcellulaire des protéines permet de mieux comprendre la fonction des organelles et la compartimentation du métabolisme des plantes. Mais la description précise du protéome d'un organite nécessite d'identifier clairement les véritables protéines résidantes du compartiment étudié. Une tâche si précise est complexe puisqu'elle nécessite la mise en place d'une préparation d'organites purs et homogènes. Pour y parvenir, un protocole de purification de vacuoles à partir de protoplastes isolés de cellules en culture sur un gradient de densité de Ficoll a été amélioré. La combinaison de plusieurs approches de protéomique a permis d'identifier les protéines présentes dans les fractions vacuolaires soluble et membranaire de façon quantitative et fonctionnelle. Les différentes approches ont ainsi mis en évidence des associations et mécanismes moléculaires complexes qui régissent les différentes activités vacuolaires. Cette protéothèque de référence constitue une base pour étudier la dynamique du protéome vacuolaire en réponse à plusieurs stress incluant les métaux lourds. Plusieurs méthodes sans a priori et ciblée ont été proposé afin d'étudier l'impact du cadmium sur la vacuole, ce compartiment cellulaire clé de la détoxication.To better understand the mechanisms governing cellular traffic, transport process of substrates across the tonoplast, storage of various metabolites and their ultimate degradation, a comprehensive and thorough analysis of Arabidopsis thaliana vacuolar proteome was performed. Protein subcellular localization knowledge is an important step toward assigning functions of organelles and plant metabolism compartmentation. But confident description of proteome organelle content requires clear identification of the true resident proteins of the studied compartment. This task involves pitfalls and requires that either organelle preparations are free of contaminants or that techniques are used to discriminate between genuine organelle residents and contaminating proteins. To achieve this, vacuoles purification protocol from protoplasts on a Ficoll density gradient has been improved. The combination of several proteomic approaches attempt to present soluble and membrane vacuolar proteins in a quantitative and functional manner. Different approaches have thus shown associations and complex molecular mechanisms that govern the various vacuolar activities. The constitute proteins library provides references to study the vacuolar proteome dynamics in response to different stresses including heavy metals. Many methods without a priori or targeted were proposed to study the impact of cadmium on the vacuole, the key cell compartment of detoxification. Proteomics provides powerful tools for characterizing the protein contents of vacuoles during cadmium stress