Maturation of protein active sites containing metals by the iron-sulfur cluster biogenesis ISC and Hyd systems

De nombreuses protéines possèdent des cofacteurs inorganiques contenant des métaux de transition. Les propriétés physico-chimiques de ces métaux permettent aux enzymes qui les portent de catalyser des réactions impossibles par l'utilisation des seules potentialités chimiques des vingt-deux acides aminés. Cependant, ces métaux sont toxiques pour la cellule lorsqu'ils sont libres. La synthèse et l'incorportion de ces cofacteurs dans les enzymes nécessitent alors des machineries protéiques complexes d'assemblage. Au cours de cette thèse, les mécanismes de synthèse des centres FeS par les machineries ISC (Iron-Sulfur Cluster) et Hyd (Hydrogenase) ont été étudiés. Le système ISC correspond à la machinerie primaire d'assemblage des centres FeS chez les bactéries, et un système équivalent existe chez les eucaryotes au niveau de la mitochondrie. Le système Hyd est la machinerie de maturation de l'hydrogénase à FeFe chez plusieurs eucaryotes inférieurs (algues et protistes) et dans une grande variété de bactéries. Dans un premier temps, nous nous sommes intéressés à la machinerie ISC d'Archaeoglobus fulgidus dont le coeur est composé de la cystéine désulfurase IscS et de la protéine échafaudage IscU ; IscS apportant le soufre nécessaire à l'assemblage du centre FeS sur IscU. Au cours de cette étude, il est apparu que IscS d'Archaeoglobus fulgidus ne possède pas d'activité cystéine désulfurase, mais qu'elle joue tout de même un rôle fondamental dans la synthèse du centre FeS sur le complexe IscSU en fournissant sa cystéine active en tant que ligand de l'agrégat. Dans un second temps, nous avons étudié la protéine à radical S-adénosyl-L-méthionine HydG, responsable de la synthèse des ligands CN- et CO du sous-agrégat à 2 Fe des hydrogénases à FeFe, qui était la seule maturase du système Hyd dont la structure n'était pas connue. Nos résultats structuraux et fonctionnels suggèrent que HydG synthétise successivement le ligand CN- dans un site actif basique, puis le ligand CO sur le cinquième Fe de son agrégat [5Fe-4S] C-terminal. Ce dernier pourrait être stabilisé par un ligand cystéine ou homocystéine.Many proteins have inorganic cofactors containing transition metals. The physicochemical properties of these metals allow the enzymes, which carry them to catalyze reactions not possible when only using the chemical properties of the twenty-two amino acids. However, these metals are toxic to the cell when they are free. Consequently, the synthesis and incorporation of these cofactors into enzymes requires complex protein assembles. In this thesis, the FeS clusters synthesis mechanisms by the ISC (Iron-Sulfur Cluster) and Hyd (Hydrogenase) machineries were studied. The ISC system corresponds to the primary FeS clusters assembly machinery in bacteria, and a homologous system exists in mitochondria. The Hyd system is FeFe-hydrogenase active site maturation machinery found in several lower eukaryotes (algae and protists) and in a wide variety of bacteria. Initially, we studied the ISC machinery from Archaeoglobus fulgidus whose core is composed of the cysteine desulfurase IscS and the scaffold protein IscU; IscS delivers the sulfur needed for the FeS assembly to IscU. From this study we conclude that IscS from Archaeoglobus fulgidus has no cysteine desulfurase activity, but it still plays a fundamental role in FeS cluster synthesis by IscSU complex by providing a cysteine ligand to the nascent cluster. Secondly, we studied the radical S-adenosyl-L-methionine HydG, responsible for the synthesis of CN- and CO ligand of the active site [FeFe] subcluster, which was the only Hyd system maturase for which the structure was unknown. Our structural and functional results suggest that HydG successively synthesizes the CN- ligand at a basic site, and then the CO ligand at the unique fifth Fe ion of its C-terminal [5Fe-4S] cluster. The latter could be stabilized by either a cysteine or a homocysteine ligand