Molecular mechanisms of platelet production and functions : role of Vps34 and impact of kinase inhibitors

Les plaquettes sanguines jouent un rôle essentiel dans le maintien de l'intégrité des vaisseaux sanguins. En cas de brèche vasculaire, elles conduisent à la formation d'un clou hémostatique via des étapes successives d'adhésion, sécrétion et agrégation finement régulées et préviennent alors un saignement excessif. Les plaquettes jouent également un rôle critique dans les pathologies thrombotiques comme l'athérothrombose, ce qui en fait des cibles pharmacologiques majeures dans ces situations. Au cours de ma thèse, deux axes de recherche ont été abordés : (i) l'étude du rôle de la PI3-kinase de classe III (Vps34) dans la formation et l'activation des plaquettes et (ii) l'étude de l'impact de nouvelles drogues ciblant les kinases en thérapie anti-cancéreuse sur les fonctions plaquettaires et l'hémostase. Dans un premier temps, je me suis concentrée sur la caractérisation du rôle de Vps34 et de son produit lipidique, le phosphatidylinositol 3 monophosphate (PtdIns3P), dans la physiologie plaquettaire à l'aide d'un modèle de souris présentant une délétion de Vps34 spécifiquement dans la lignée mégacaryocyte/plaquette (PF4-Cre/Vps34lox/lox). Nous avons observé une microthrombopénie modérée associée à un défaut de migration des mégacaryocytes ainsi que des anomalies morphologiques des granules de sécrétion. Ce phénotype apparaît lié à une diminution de taux de PtdIns3P associé à un trafic vésiculaire perturbé. De plus, nous avons mis en évidence une altération des fonctions prothrombotiques des plaquettes, ex vivo en conditions de flux mais aussi in vivo en conférant aux souris une protection contre la thrombose induite à la carotide par lésion au chlorure ferrique. La contribution de Vps34 dans les mécanismes d'activation plaquettaire, indépendamment de son rôle dans le mégacaryocyte, a été montrée ex vivo via l'utilisation de nouveaux inhibiteurs spécifiques de Vps34 (SAR405 et INH1) récemment développés pour une application en oncologie, notamment pour réduire la résistance de certains cancers aux chimiothérapies. Dans un second temps, je me suis intéressée à l'impact des nouvelles thérapies ciblées anticancéreuses sur les plaquettes afin de comprendre la majoration du risque hémorragique associée à ces molécules. Nous avons étudié l'effet de l'ibrutinib, un inhibiteur des tyrosine-kinases de la famille BTK activées en aval des PI3-kinases de classe I, utilisé en clinique dans le traitement des hémopathies lymphoïdes B (lymphomes et leucémie lymphoïde chronique). L'exploration des fonctions plaquettaires au sein d'une cohorte de patients du service d'hématologie du CHU-Toulouse a permis de corréler les signes hémorragiques de certains patients traités par ibrutinib avec un défaut de signalisation plaquettaire en aval des récepteurs GPVI et GPIb, se traduisant par une diminution de l'agrégation au collagène et au CRP et par un défaut d'adhésion sur matrice de facteur von Willebrand en conditions de flux. En conclusion, mes travaux de thèse (i) apportent de nouvelles données fondamentales sur la participation de Vps34 dans les mécanismes de production et d'activation plaquettaires et (ii) ont permis de proposer des recommandations quant à l'utilisation clinique des nouvelles thérapies ciblées anti-cancéreuses.Blood platelets play an essential role in the maintenance of vascular integrity. They prevent excessive blood loss after vessel injury by orchestrating haemostatic clot formation through successive steps of adhesion, secretion and aggregation. Platelets are also major pharmacologic targets as they participate in thrombotic pathologies such as atherosclerosis. My thesis work was focused on two axis: (i) the role of class III PI3-kinase (Vps34) in platelet formation and activation and (ii) the impact of new anticancer drugs targeting kinases on platelet functions and haemostasis. First, I studied the role of Vps34 and its lipid product, phosphatidylinositol 3 monophosphate (PtdIns3P), in platelet physiology using a unique mouse model of Vps34 deletion specifically in megakaryocyte lineage (PF4-Cre/Vps34lox/lox). We observed a moderate microthrombocytopenia associated to a defect in megakaryocyte migration and morphologic abnormalities in secretion granules. This phenotype is linked to a decrease in PtdIns3P level associated with defective vesicular trafficking. Moreover, PF4-Cre/Vps34lox/lox mice exhibit altered prothrombotic functions, ex vivo in shear conditions and in vivo by conferring a protection against ferric chloride-induced carotid thrombosis. A role for Vps34 in platelet activation, independently from its role in megakaryocyte, was shown ex vivo using two specific Vps34 inhibitors (SAR405 and INH1) recently developed to reduce autophagy-mediated resistance to chemotherapy. Secondly, I assessed the impact of new targeted drugs used in cancer therapy on platelets in order to understand the increased bleeding risk associated to these molecules. We studied the effect of ibrutinib, a specific inhibitor of BTK family tyrosine kinases recently approved for the treatment of B malignancies (mantle cell lymphoma, chronic lymphocytic leukemia). By exploring platelet functions of ibrutinib-treated patients treated from Hematology department of Toulouse, we correlated bleeding symptoms to a defective platelet signaling downstream GPVI and GPIb receptors as shown by a strongly reduced platelet aggregation in response to collagen and CRP and by a defect in platelet adhesion on von Willebrand matrix under flow conditions. In conclusion, my thesis work (i) brings fundamental insights about Vps34 contribution in mechanisms of platelet production and functions and (ii) allows recommendations about clinical use of new targeted molecules in cancer therapy