Chromatin dynamics of enhancer activation during cell differentiation

La différenciation cellulaire implique une régulation transcriptionnelle coordonnée et finement contrôlée qui passe par le recrutement de facteurs de transcription (FT) cellules-spécifiques sur des régions génomiques régulatrices appelées enhancers. Parmi ces FT, des protéines nommées « facteurs pionniers » (FP) lient la chromatine condensée et favorisent la transition des enhancers d’un état inactif vers un état « préparé » (étape de « priming »), facilitant ainsi la fixation d’autres FT et permettant l’activation de ces régions. L’engagement vers un lignage cellulaire particulier est donc associé à l’engagement des FP au niveau d’enhancers dont la structure chromatinienne subit des changements architecturaux associés à la mise en place de marques spécifiques. Celles-ci incluent, la monométhylation de la lysine 4 de l’histone H3 (H3K4me1), l’acétylation de la lysine 27 de l’histone H3 (H3K27ac) ou encore des modifications des résidus cytosine (5-méthylcytosine, 5mC ; 5-hydroxyméthylcytosine, 5hmC). La 5hmC est un intermédiaire de la voie de déméthylation active : elle résulte de l’oxydation de la 5mC par les enzymes « Ten Elven Translocation » (TET) et peut être à son tour oxydée en 5-formylcytosine (5fC) et 5-carboxylcytosine (5caC) qui sont ensuite remplacées par des cytosines via l’intervention du système « Base Excision Repair ». Cependant, du fait de sa stabilité et de sa capacité à lier des protéines particulières, la 5hmC pourrait également jouer un rôle spécifique. De précédents travaux ont d’ores et déjà mis en évidence un lien entre le recrutement des FP et les modifications des cytosines. Néanmoins, l’implication des processus de méthylation/déméthylation dans la régulation spatio-temporelle des étapes de « priming » et d’activation des enhancers n’a pas encore été caractérisée. Dans ce contexte, l’objectif de cette étude à été de définir le rôle des modifications de cytosines (5mC et 5hmC) lors de l’activation des enhancers liés par des FP. Pour ceci, nous avons analysé d’une part, l’implication des processus de méthylation et déméthylation des cytosines sur le « priming » et l’activation des enhancers, en utilisant des inhibiteurs des ADN méthyltransférases ou des enzymes TET. D’autre part, nous avons entrepris d’identifier les dynamiques de « priming » et d’activation des enhancers à l’échelle du génome au cours de la différenciation neurale, en lien avec la présence de la 5hmC. Les résultats obtenus nous ont notamment permis de proposer un schéma d’activation des enhancers dans lequel les dynamiques de méthylation/déméthylation de l'ADN jouent un rôle essentiel dans la structuration de la chromatine.Cell differentiation relies on a coordinated and finely regulated transcriptional regulation involving the recruitment of cell-type transcription factors (TFs) on genomic regions called enhancers. Some of these TFs, named pioneer factors (PFs), are able to bind to condensed chromatin and favour enhancer transition from an inactive to a primed state, thus facilitating the binding of other TFs and enhancer activation. Therefore, lineage commitment is associated to the engagement of PFs at enhancers where the chromatin structure undergoes architectural modifications related to the set up of specific marks. These include, the monomethylation of the lysine 4 of the histone H3 (H3K4me1), the acetylation of the lysine 27 of the histone H3 (H3K27ac) or cytosine modifications (5-methylcytosine, 5mC; 5-hydroxymethylcytosine, 5hmC). The 5hmC base is an intermediate in the process of active demethylation coming from the oxidation of the 5mC by the Ten Elven Translocation (TET) enzymes and can itself be further oxidized in 5-formylcytosine (5fC) and 5-carboxylcytosine (5caC), two bases which are then replaced by cytosines through the Base Excision Repair mechanism. Nevertheless, due to its stability and its ability to bind some specific proteins, 5hmC might also play specific roles. Previous works already highlighted a link between the recruitment of PFs and cytosine modifications. However, the involvement of the methylation/demethylation processes in the spatio-temporal regulation of the priming and activation of enhancers has not yet been characterized. In this context, the aim of this study was to define the role of cytosine modifications (5mC and 5hmC) during the activation of enhancers bound by PFs. For this, we analyzed the implication of cytosine methylation and demethylation processes on enhancer priming and activation by using DNA methyltransferases or TET inhibitors. In addition, we identified the dynamics of enhancer priming and activation genome-wide during neural differentiation, in relation to the presence of 5hmC. The results allow us to propose a scheme of enhancer activation in which DNA methylation/demethylation dynamics play an essential role in the chromatin structure of these regulatory elements