A new assay method for absolute quantification of total plasmatic bevacizumab by LCMS/ MS in human serum comparing two internal standard calibration approaches

La quantification des anticorps monoclonaux (mAbs) dans le plasma est un pré-requis essentiel pour les études PK/PD. Les méthodes de références pour quantifier actuellement les mAbs sont de type ELISA mais les difficultés rencontrées notamment lorsque l’analyse porte sur des mAbs dont la cible pharmacologique est circulante, suggèrent que la spectrométrie de masse serait une alternative intéressante. Appliquée au bevacizumab, la stratégie développée fait appel à la spectrométrie de masse en tandem utilisée en mode MRM (HPLC-ESI-QqQ) et porte sur l’analyse des peptides spécifiques du bevacizumab obtenus à l’issu d’une protéolyse trypsique. La quantification absolue est réalisée à l’aide d’une droite de calibration obtenue à partir du ratio des aires des peptides du bevacizumab et de l’étalon interne. Afin de proposer une méthodologie de quantification de référence, nous avons définie les points clés du développement pour la transposition à d’autre mAbs et comparé les deux stratégies d’étalonnage interne les plus employées : l’une utilisant une protéine analogue et l’autre un peptide marqué par des isotopes stables (SIL-peptide). A travers ce développement la stratégie proposée présente un caractère universel vis-à-vis des anticorps monoclonaux de type IgG dont le traitement des échantillons repose sur une purification par protéine A suivit d’une concentration par ultrafiltration et dont la quantification fait appel à l’approche d’étalonnage interne SIL-peptide. Validée selon les recommandations de la FDA, notre méthode présente les performances analytiques attendues en termes de sensibilité, répétabilité et spécificité pour être appliquée à des études cliniques.The quantification in plasma of monoclonal antibodies (mAbs) is an essential prerequisite to any PK/PD preclinical and clinical study. To date, reference techniques used to quantify mAbs, rely on enzyme-linked immunosorbent assay (ELISA) but the difficulties encountered in particular when the analysis focuses on the mAbs whose pharmacological target is circulating, suggest that mass spectrometry would be an interesting alternative. Applied to bevacizumab, the quantification developed strategy involves tandem mass spectrometry (HPLC-ESI-QqQ) used in MRM mode and focuses on the analysis of specific peptides bevacizumab obtained after tryptic proteolysis. Absolute quantification is achieved through calibration curve obtained from peak area ratios of bevacizumab surrogate peptide and internal standard. To propose a reference quantification methodology, we have identified the key points of development for transposition to other mAbs and compared the two most commonly used internal calibration approaches: one using protein analogue and the other a stable isotope labeled surrogate peptide (SIL-peptide). Through this development, the proposed strategy has a universal character with respect to IgG monoclonal antibodies subclasses which is based on sample processing purification using protein A followed by concentration by ultra filtration and whose quantification involves the internal calibration approach SIL-peptide. Validated according to FDA guidelines, our method shows the expected analytical performance in terms of sensitivity, specificity and repeatability for application in clinical studie