Development of a continuous bioprocess coupling production and purification of recombinant antibody.

Les anticorps monoclonaux sont une classe de bio médicaments en plein essor. Leur production est largement étudiée afin d’obtenir des rendements de plus en plus élevés et de réduire les coûts. Cette thèse décrit le développement d’un procédé complet en continu, de la production d’anticorps recombinants par des cellules mammifères jusqu’à leur purification. L’objectif est de coupler la culture cellulaire en mode perfusion à la purification par chromatographie semi-continue. Le développement du procédé se fait en bioréacteur avec une lignée de cellules d’ovaires de hamster chinois (CHO-DP12) transformée pour produire un anticorps anti-Interleukine 8 utilisée, comme modèle. Après adaptation, les cellules ont été cultivées en mode batch afin de connaitre le comportement de la lignée en environnement contrôlé. Ensuite, un procédé de perfusion de 2L de culture avec recyclage cellulaire a été mis en place. Le principal enjeu est de maintenir un état stationnaire avec une concentration cellulaire constante et déterminer le débit optimal d’alimentation spécifique par cellule (CSPR). Plusieurs méthodes ont été testées et comparées pour la détermination de ce CSPR optimal. Le procédé de culture en perfusion a ensuite été maintenu pendant 24 jours à des concentrations cellulaires de 10, 20 et 40 millions de cellules par mililitres. Les anticorps produit par différents modes de culture ont été caractérisés (batch, fed-batch et perfusion). Les N-glycosylations, les variants de charge ainsi que la thermo-stabilité des anticorps ont été étudiés. Les résultats montrent que les anticorps produits présentent des caractéristiques similaires quel que soit le mode de production.Pour la purification, une étude préliminaire a permis de caractériser le comportement du filtrat sur la résine chromatographique d’affinité MabSelect Sure LX en chromatographie classique. Un procédé semi-continu a été simulé grâce au logiciel BioSC® Predict puis testé et optimisé sur le chromatographe BioSC®. Il comprend la purification de l’anticorps mais aussi les étapes de nettoyages et de sanitisation. Un premier essai de couplage production/purification a pu être réalisé avec succès pendant 32h et a permis d’obtenir un niveau de pureté similaire à la chromatographie classique. La productivité a été augmentée de 23% (en grammes d’anticorps purifié par litre de résine et par jour) et le volume de tampon utilisé a été réduit de 25%. De plus, le couplage production/purification a permis de s’affranchir du stockage de volumes importants de filtrat (7,2L de filtrat par jour de production en perfusion). Enfin, une étude de coût de production, à l’échelle « laboratoire », a été réalisée afin de déterminer, en fonction de la productivité du clone et de la quantité d’anticorps à produire, la différence de rentabilité entre une production en batch ou en perfusion à différents CSPR.Monoclonal antibodies are a biopharmaceuticals class of growing interest. Their production is widely studied to obtain higher yields and to reduce costs. This thesis describes the development of a complete continuous process, from the production of recombinant antibodies by mammalian cells until their purification. The objective is to connect cell culture in perfusion mode to a semi-continuous chromatographic purification. The development of the process was done in a bioreactor with a Chinese hamster ovary cell line (CHO-DP12) transformed to produce an anti-interleukin-8 antibody used as a cell model. After adaptation, the cells were cultured in batch mode in order to study the behavior of the cell line in controlled environment. Then, a 2L culture perfusion process with cell recycling was set up. The main challenge is to maintain a steady state with constant cell concentration and to determine the optimal cell-specific perfusion rate (CSPR). Several methods were tested and compared for the determination of this optimal CSPR. The perfusion process was maintained for 24 days at cell concentrations of 10, 20 and 40 million cells per mililiters. The antibody produced by different culture methods was compared (batch, fed-batch and perfusion). The N-glycosylations, the charge variants as well as the thermo-stability of the antibody were studied. The results show that the produced antibody have similar characteristics whatever the chosen production mode. For purification process, we performed a preliminary study to characterize the behavior of the supernatant on the chromatographic affinity resin MabSelect Sure LX. A semi-continuous process was simulated through BioSC® Predict software and then tested and optimized on the BioSC® chromatograph. It includes antibody purification but also cleaning and sanitizing steps. A first production/purification coupling test was successfully carried out for 32 h. It provides antibodies at a purity level similar to that of the conventional chromatography. Productivity was increased by 23% (in grams of purified antibody per liter of resin per day) and the volume of buffer used was reduced by 25%. In addition, production/purification coupling prevented storage of large volumes of supernatant (7,2L of supernatant per production day in perfusion mode). Finally, a cost-of-production study, at research scale, was carried out to determine, depending on the productivity of the clone and the antibodies amount, the difference of costs between batch or perfusion production according to different CSPRs