Investigating the function of GCPs 4, 5, 6 in the Gamma-tubulin ring complex assembly

Les microtubules sont des composants hautement dynamiques du cytosquelette. La tubuline gamma est localisée au centrosome. Elle y forme le complexe de nucléation des microtubules, le gamma-TuRC, en association avec les protéines GCPs 2-6. Les GCPs 2-6 forment une famille de protéines caractérisée par deux domaines conservés appelés GRIP1 et 2. De par sa structure, le gamma-TuRC sert de moule pour la nucléation des microtubules. Le gamma-TuRC est constitué de plusieurs sous-complexes : les gamma-TuSCs qui sont composés d'une GCP2 et d'une GCP3 qui interagissent entre elle par leur domaine amino-terminal, chacune liant une tubuline gamma via leur domaine carboxy-terminal. Les gamma-TuSCs s'assemblent latéralement pour former une structure à un tour d'hélice, les deux extrémités de l'hélice se recouvrant. La structure atomique de GCP4 s'intègre particulièrement bien dans structure du gamma-TuSC de levure, obtenue en microscopie électronique, à la place de GCP2 et 3 suggérant une forte conservation structurale entre les GCPs. GCP4, 5 et 6 pourraient donc être partie intégrante de l'hélice. Durant ma thèse j'ai étudié la position relative des GCP4, 5 et 6 au sein du gamma-TuRC. Pour cela j'ai développé des approches d'échange de domaines et de mutagénèse. J'ai également mis en place des stratégies de FLIM-FRET et d'immunoprécipitation. J'ai ainsi montré que c'est le domaine N-terminal des GCPs qui définit leur identité, les domaines C-terminaux étant échangeables. J'ai également mis en évidence, au sein du gamma-TuRC, des interactions latérales entre GCP4 et GCP5 semblables à celles établies par GCP2 et GCP3 dans les gamma-TuSC. J'ai également pu isoler un complexe contenant GCP4, 5, 6 et la tubuline gamma indépendamment du gamma-TuRC. J'apporte ainsi les premières preuves expérimentales soutenant l'idée que GCP4, 5 et 6 sont partie intégrante de l'hélice du gamma-TuRC et qu'elles y forment un sous complexe qui occupe une position bien définie.Microtubules are highly dynamic components of the cytoskeleton. gammatubulin is found at the centrosome where it forms a microtubule nucleation complex together with GCPs 2-6, the gamma-TuRC. GCPs 2-6 form a conserved family of proteins characterised by two conserved domains called GRIP1 and 2. The gamma-TuRC functions as a structural template for microtubule nucleation. The gamma-TuRC is composed of smaller subcomplexes called gamma-TuSC. Each gamma-TuSC is composed by one GCP2, one GCP3 and two gamma?tubulins. GCP2 and GCP3 interact via their N-terminal domain and bind gamma tubulin through their C-terminal domain. Several gamma-TuSCs can assemble laterally to form a one-turn helix with the two ends overlapping. The atomic structure of GCP4 fits almost perfectly in the place of GCP2 and GCP3 within the gamma-TuSC envelope obtained by electron microscopy suggesting a strong structural conservation among GCPs. Hence, GCP4, 5 and 6 may be part of the helix. During the course of my thesis, I studied the relative position of GCPs 4, 5, 6 within the gamma-TuRC. To this aim, I developed a domain swapping and mutagenesis approaches. I also combined FLIM-FRET and immunoprecipitation strategies. I have been able to show that the N-terminal domains of GCPs define their identity while the C-terminal domains can be swapped. My results also indicate that GCP4 and GCP5 establish gamma-TuSC like interactions within the gamma-TuRC. I also isolated a complex containing GCP4, 5, 6 and gamma tubulin independently of the gamma-TuRC. My thesis provides the first experimental evidence supporting the model where GCP4, 5 and 6 are part of the gamma-TuRC helix where they form a sub-complex localised at a defined position