Control of spinal networks within the lamina II of the spinal cord by C-LTMRs fibers : optogenetic and pharmacological approaches

La perception de la douleur résulte de l'intégration dans la moelle épinière des informations sensorielles et nociceptives transmises par les afférences primaires. Parmi celles-ci, les Mechanorécepteurs C à bas seuil (C-LTMR), exprimant la chimiokine TAFA4, ont été identifiés comme des modulateurs de la douleur. Cependant, les mécanismes sous-jacents au contrôle de l'intégration sensori-nociceptive par TAFA4 restent mal compris. Grâce aux enregistrements obtenus in vitro par patch clamp chez des souris naïves, nous montrons que l'application exogène de TAFA4 induit une diminution de la fréquence des courants post-synaptiques excitateurs spontanés (CPSE). A l’inverse nous observons une augmentation de la fréquence des événements synaptiques inhibiteurs spontanés (CPSI). Cette modulation de l'activité synaptique est préservée avec TTX, indiquant que TAFA4 modifie la transmission synaptique par des mécanismes présynaptiques. En stimulant les fibres nociceptives à haut seuil d’activation, nous démontrons que TAFA4 induit une augmentation du ratio des réponses synaptiques des interneurones évoquées par des stimulations d’impulsions pairées. Par conséquent, TAFA4 renforce l'inhibition présynaptique des fibres nociceptives. Nous démontrons également que les effets de TAFA4 sur la transmission excitatrice spontanée et évoquée sont bloqués par des antagonistes des récepteurs GABA, indiquant que les C-LTMRs interagissent principalement avec les neurones GABAergiques. De plus, des expériences de microscopie électronique ont révélé la présence de contacts synaptiques directs entre les C-LTMRs et les terminaisons GABAergiques dans la lamina IIi. Pour aller plus loin dans la caractérisation des effets de TAFA4 sur la transmission de la douleur, nous avons induit une inflammation de la patte arrière des souris (modèle CFA). Chez ces souris, l'effet de TAFA4 sur la fréquence EPSC et IPSC est conservé. Nous constatons que chez les souris CFA, TAFA4 diminue la décharge neuronale enregistrée in vivo suite à une stimulation mécanique nociceptive de la patte inflammée. Cet effet est bloqué par une injection d'antagonistes des récepteurs GABA. En effectuant le test Von Frey sur des souris inflammées, nous montrons que l’action anti-allodynique induite par l'injection intrathécale de TAFA4 est bloquée par les antagonistes des récepteurs GABA. Nous avançons l’hypothèse que les C-LTMRs contactent directement les interneurones GABAergiques de la corne dorsale et, via la libération de TAFA4, renforcent l'activité synaptique inhibitrice participant à l’effet anti-nociceptif de TAFA4. En outre, TAFA4 favorise la rétraction microgliale chez les animaux inflammés, ainsi qu'une augmentation du nombre de synapses inhibitrices sur les somas des neurones de la lamina IIi. En conclusion, ces résultats identifient les interneurones GABAergiques comme premier relais d'intégration pour les C-LTMRs et mettent en évidence une nouvelle interaction entre les neurones sensoriels, les cellules microgliales et les interneurones de la moelle épinière, permettant une modulation fine de l'activité inhibitrice et de la transmission nociceptive en situation pathologique.Pain elaboration results from the integration within dorsal spinal cord of sensory and nociceptive information conveyed by primary afferents. Among these, C low-threshold Mechano Receptors (C-LTMR), expressing the chemokine TAFA4, were identified as modulators of pain. However, mechanisms underlying the control of sensori-nociceptive integration by TAFA4 remains poorly understood. Using in vitro patch clamp recording on spinal cord slices of naïve mice we show that, bath application of TAFA4 induces a decrease in frequency of spontaneous excitatory post synaptic currents (EPSCs). This effect is mirrored by an increase in frequency of spontaneous inhibitory synaptic events (IPSCs). This modulation of synaptic activity is preserved with TTX, indicating that TAFA4 alters synaptic transmission through presynaptic mechanisms. By recruiting high threshold nociceptive fibers, we demonstrate that TAFA4 induces an increase in the paired pulse ratio of evoked synaptic responses in interneurons, and thus, reinforces presynaptic inhibition of nociceptive fibers. We also demonstrate that the effects of TAFA4 on spontaneous and evoked excitatory transmission are blocked by antagonists of GABA receptors, indicating that -C-LTMRs mainly interact with GABAergic neurons. Moreover, Electron Microscopy provides evidence of direct synaptic contacts between C-LTMRs and GABAergic terminals in lamina IIi. To further characterize the effects of TAFA4 on pain transmission, we inflamed mice using Complete Freund Adjuvant (CFA). In CFA mice, the effect of TAFA4 on EPSC and IPSC frequency is preserved. We find that in CFA mice, TAFA4 decreases the neuronal discharge recorded in vivo following a nociceptive mechanical stimulation in inflamed hindpaw. This effect is blocked by an injection of GABA receptors antagonists. By performing Von Frey test on inflamed mice, we show that intrathecal injection of TAFA4 provides anti-allodynic effects blocked by GABA receptors antagonists. We propose that C-LTMR directly contact GABAergic interneurons in dorsal horn, and, through the liberation of TAFA4 reinforce inhibitory synaptic activity which may in turn promote their anti-nociceptive activity. Furthermore, TAFA4 promotes microglial retraction in CFA inflamed animals, together with an increase in the number of inhibitory synapses on lamina IIi somata. Altogether, these results identify GABAergic interneurons as the first integration relay for C-LTMRs and highlight a novel interplay between sensory neurons, microglial cells and spinal interneurons leading to a fine tuning of inhibitory activity and nociceptive transmission in pathological conditions