Effects of endocrine disruptors on skeletal development

Les polluants environnementaux, en particulier les perturbateurs endocriniens (PE), agissent à très faibles doses sur des cibles multiples. Les effets rapportés portent en majorité sur les organes de reproduction. Très peu d’études ont porté sur le squelette alors que le cartilage et l’os sont sous un puissant contrôle hormonal, depuis le stade fœtal où le système hormonal se met en place jusqu’au vieillissement, en passant par la naissance (hormones thyroïdiennes, hormone de croissance), la puberté et la ménopause chez la femme (stéroïdes sexuels). L’objectif de ce travail est d’étudier les effets de polluants anti-androgènes (vinclozoline, V et métabolite actif M2) ou xenestrogènes (génistéine, G; bisphénol A, BPA), in vivo sur le développement du squelette du rat Wistar et in vitro sur les marqueurs de différenciation chondrogéniques. Les effets in vivo ont été étudiés à des doses inférieures aux “No Observed Adverse Effect Levels ” (NOAEL) fixés par les instances européennes (EFSA) et internationales (US EPA). Des rattes ont été exposées à V, G seuls, combinés (GV) et/ ou associés au BPA (BGV), et ce de la conception des petits jusqu’à leur sevrage (J30) ou leur sacrifice (J30, J110). Les effets ont été recherchés sur des petits de mères et portées différentes, quatre pour chaque traitement, âge et sexe. Les effets in vitro du métabolite M2 de la Vinclozoline, associé ou non avec G et BPA, ont été étudiés sur l’expression de marqueurs chondrogéniques en utilisant : 1) un modèle murin de cellules souches inductibles vers la voie chondrogénique (C1) pour les effets sur la différenciation chondrogénique précoce et 2) des chondrocytes de souriceaux nouveau-nés, différenciés en culture primaire ou dédifférenciés (passages répétés). Comparaison avec les effets du bFGF, facteur de dédifférenciation chondrogénique. Résultats : In vivo, l’exposition à V, seule ou associée à G ou au BPA induit chez les rattes F1 exposées, une cannelure de la queue, discrète mais perceptible à la palpation en regard de chaque articulation intervertébrale. Les xénestrogènes tendent à réduire cet effet de V. Les rats et les animaux F2 ne sont pas atteints. L’examen par micro CT-scan montre une augmentation significative de la largeur des apophyses transverses (ITA) des vertèbres, et une diminution de la hauteur des corps vertébraux chez les rattes F1 exposées en regard des contrôles. Ces modifications anatomiques rappellent certaines pathologies génétiques des collagènes (dysplasies épiphysaires) chez l’homme Elles sont absentes chez les rats F1 et les animaux F2. Elles sont en partie transitoires car présentes à J30 (effets sur ITA et longueur) quand seul l’effet sur l’ITA perdure à J110. L’examen histologique des cartilages de croissance des corps vertébraux montre un déséquilibre entre les zones de prolifération et d’hypertrophie qui évoque une modification de la maturation du cartilage de type estrogénique. Ces effets sont ici aussi transitoires et majoritairement observés chez les rattes. L’effet plus prononcé du BPA lisse toutes les autres activités. Cela suggère que les PE pourraient moduler la différenciation du cartilage de croissance. C’est ce qui a été étudié in vitro. In vitro. Le premier objectif était d’évaluer les effets des PE sur la dynamique d’induction chondrogénique (cellules C1). Nous montrons que l’addition de M2 seul ou avec G ou BPA modifie le processus de maturation du collagène2 sans effet sur les autres marqueurs (SOX9, Agrécane, Col10). M2 prolonge l’expression de COL2A immature et retarde son remplacement par l’isoforme COL2B. Le second objectif était d’étudier les effets des PE sur la régulation de l’expression de COL2A au cours du processus de dé-différenciation des chondrocytes in vitro. L’expression de COL2A augmente avec le degré de dédifférenciation cellulaire (passages successifs) et double en présence de M2, G et BPA. Cet effet dépend des récepteurs aux estrogènes (ER) et des voies p38-MAPK. (...)Environmental pollutants, particularly Endocrine Disruptors (ED), show effects on multiple targets at very low doses. Mostly known effects target reproductive organs. Very few studies are conducted on skeleton, although cartilage and bone are under potent hormonal control, from fetal stage, where hormonal system takes place, until aging, through birth stage (thyroid hormones, growth hormones), puberty and menopause for women (steroid hormones). The aim of this work is to study effects of anti-androgenic pollutants (vinclozolin, V, and its active metabolite M2) or xenoestrogens (genistein, G; bisphenol A, BPA), in vivo on Wistar rat skeletal development and in vitro on chondrogenic differenciation markers.In vivo effects were studied at doses below the “No Observed Adverse Effect Levels” (NOAEL) established by European and American agencies (EFSA and US EPA respectively). Female Wistar rats were exposed to V and G alone, in combination (GV) and/or associated to BPA (BGV), from pups conception until weaning (d30) or sacrifice (d30, d110). Effects were investigated on offsprings from different mothers and litters, on four animals by treatment, age and gender. In vitro effects of M2 metabolite of Vinclozolin, combined or not to G and BPA, were studied on chondrogenic markers expression using : 1) inducible murine stem-cells model towards chondrogenesis (C1) to sudy effects on early chondrogenic differentiation and 2) post-natal mouse differentiated chondrocytes, in primary culture or dedifferenciated chondrocytes by successive passages. Comparison with bFGF, a dedifferentiation factor for chondrocytes.Results : In vivo, exposure to V, alone or combined to G or BPA, induce discrete but palpable annealing in F1 treated female rat tails, in front of each intervertebral articulation. Xenoestrogens tend to decrease V effect. Male rats and F2 offsprings were not affected. Micro-CT Scan analysis shows significative increase of vertebrae inter transverse apophyses (ITA) distance, and decrease of vertebral body height in F1 female rats comparing to control animals. Anatomical modifications recall human collagen genetic diseases (epiphyseal dysplasias). They are absent in F1 male rats and F2 offsprings. Furthemore they are partly transient, ITA and height effects being present at d30 whereas ITA effect alone remains until d110. Histological analysis of vertebral body growth plate shows unbalance between proliferative and hypertrophic zones, which evokes estrogenic acceleration of cartilage maturation. Those effects are still transient and mainly observed in female rats. BPA activity is dominant above G and V effects. This result suggests ED can modulate growth plate cartilage differentiation, which was studied in vitro. In vitro : First, we aimed to evaluate eventual role of ED on the dynamic of the chondrogenic differentiation process. We show that M2 addition, alone or in combination with G or BPA, modifies collagen 2 maturation process without any effect on other markers (SOX9, Agrecan, COL10). M2 addition extends immature isoform COL2A expression and delays its replacement by mature isoform COL2B. Second, we studied the effects of ED on the regulation of COLA expression through the dedifferentiating process of chondrocytes in vitro. COL2A expression increases with cell dedifferenciation degree (successive passages) and double with M2, G and BPA. No other chondrogenic marker was modified. This effect depends on estrogen receptors (ER) and p38-MAPK pathway. (...