EGCG and delphinidin : two new natural inhibitors of hepatitis C virus entry

L’hépatite C est un problème majeur de santé publique qui touche environ 160 millions de personnes dans le monde. L’agent étiologique responsable de cette maladie, le virus de l’hépatite C (HCV), est un petit virus enveloppé dont le génome est codé par un acide ribonucléique (ARN) simple brin de polarité positive. Actuellement, il n’existe aucun vaccin contre ce pathogène et les traitements utilisés sont insatisfaisants du fait de leur spécificité d’action limitée. Ainsi, afin d’établir une thérapie antivirale efficace évitant l’apparition et la sélection de mutants de résistance aux antiviraux, l’utilisation de plusieurs agents antiviraux ciblant directement la particule virale (direct acting antiviral agents ou DAAs) en combinaison est préconisée. C’est pourquoi la découverte de nouveaux DAAs à large spectre d’action ciblant diverses étapes du cycle viral infectieux est indispensable.Au cours de ma thèse, nous avons identifié un nouvel inhibiteur de l’entrée du HCV : l’épigallocatéchine-3-gallate (EGCG). Cette molécule, extraite du thé vert, inhibe l’infection des cellules par le HCV. Plus précisément, en utilisant des particules rétrovirales pseudotypées avec les glycoprotéines d’enveloppe E1 et E2 du HCV, nous avons démontré que cette catéchine naturelle, agit à une étape très précoce de l’entrée virale, indépendamment du génotype. De même, en nous servant du virus produit en culture cellulaire, nous avons montré que cette molécule agit directement sur la particule virale. Puis, par RT-PCR quantitative (quantitative real-time polymerase chain reaction), nous avons confirmé l’inhibition de la liaison du virus à la surface cellulaire, en présence d’EGCG. Par conséquent, nos travaux suggèrent que l’EGCG interagit avec la particule virale, probablement en se liant aux glycoprotéines d’enveloppe virales, bloquant ainsi une étape initiale d’attachement entre le virus et les facteurs cellulaires présents à la surface de l’hépatocyte. Puis, en inhibant la transmission libre du virus, à l’aide, soit d’agarose, soit d’anticorps neutralisants, nous avons démontré que l’EGCG inhibe la transmission du virus de cellule à cellule. Enfin, nous avons montré que l’EGCG élimine le virus présent dans le surnageant de culture cellulaire après quatre passages successifs sur des cellules naïves.La concentration d’EGCG nécessaire pour inhiber la moitié de l’infection virale (IC50) en culture cellulaire est 11 µM. Ainsi, afin d’identifier de nouvelles molécules présentant un mode d’action similaire à celui de l’EGCG et possédant une meilleure activité antivirale, nous avons sélectionnés différentes molécules naturelles et les avons testés pour leur potentiel effet anti-HCV. C’est ainsi que le chlorure de delphinidine, une anthocyanidine, a également été identifié en tant que nouvelle molécule inhibitrice de l’entrée du HCV. De même que l’EGCG, le chlorure de delphinidine cible directement la particule virale à une étape précoce de l’entrée, indépendamment du génotype, probablement en inhibant l’attachement du virus à la surface cellulaire et sans affecter ni l’étape de réplication, ni l’étape d’assemblage/maturation. De plus, le chlorure de delphinidine présente une activité anti-HCV améliorée avec une IC50 de 3 µM.Finalement, au cours de cette thèse, nous avons identifié deux nouvelles molécules naturelles inhibant l’étape d’entrée virale du HCV. Ces molécules pourraient être utilisées comme nouveau traitement en combinaison avec d’autres DAAs et pourraient également servir d’outil afin d’étudier les mécanismes d’entrée du HCV dans l’hépatocyte.Hepatitis C is a major global health burden with 160 million infected individuals worldwide. This long-term disease, caused by a small positive-strand ribonucleic acid (RNA) enveloped virus, namely hepatitis C virus (HCV) evolves slowly. Nowadays, no vaccine is available and current treatments are unsatisfactory due to their restricted spectrum of action. For this reason, it is suggested that the combination of several drugs will prevent viral resistance and might conduct to an efficient antiviral therapy. Thus, the discovery of new direct acting antiviral agents (DAAs), with a broad spectrum of action, targeting different steps of the virus life cycle is still needed. Here, we identified (-)-epigallocatechin-3-gallate (EGCG) as a new inhibitor of HCV entry. Epigallocatechin-3-gallate, extracted from green tea, inhibits HCV infection. More precisely, this natural catechin molecule acts at a very early step of entry regardless of the genotype as illustrated with HCV pseudoparticles expressing HCV envelope glycoproteins E1 and E2 assays and cell-cultured HCV assays. Moreover, this molecule inhibits the docking of the virus to the cell surface as showed by the quantification of bound viruses during the attachment step using quantitative real-time polymerase chain reaction. Furthermore, EGCG inhibits viral cell-to-cell transmission as demonstrated by inhibiting cell-free transmission using agarose or neutralizing antibodies assays. Finally, EGCG clears HCV from cell culture supernatants after four passages.The half maximal inhibitory concentration (IC50) of EGCG in cell culture is approximately 11 µM. In order to identify new molecules exhibiting an enhanced anti-HCV activity and displaying similarities from EGCG scaffold, a series of natural compounds were selected and were tested for their anti-HCV activities. Thus, the anthocyanidin delphinidin chloride was identified as another inhibitor of HCV entry. Like EGCG, delphinidin chloride acts directly on the virus at a very early step of entry, regardless of the genotype, probably by inhibiting the docking of the virus to the cell surface without affecting replication or viral assembly/secretion. Finally, with an IC50 of 3 µM, delphinidin chloride displays a more potent anti-HCV activity.Together, these data indicate that EGCG and delphinidin chloride are new interesting anti-HCV molecules that inhibit entry and might be used as a new treatment in combination with other DAAs. Furthermore, these two inhibitors might be novel tools to further dissect the mechanisms of HCV entry into the hepatocyte