Quantification of nucleotides pools with liquid chromatography coupled with tandem mass spectrometry : applications in cancer research

Les nucléotides, terme regroupant les nucléosides monophosphate, diphosphate et triphosphate, sont impliqués dans de nombreux processus cellulaires. Ils représentent les éléments constitutifs des acides nucléiques, fournissent de l'énergie à des réactions métaboliques, jouent le rôle de transporteurs et seconds messagers. L'exploration des pools nucléotidiques apparaît indispensable afin de connaître leur rôle précis dans des situations physiologiques ou pathologiques. Nous avons développé une méthode de dosage des nucléotides endogènes (formes mono-, di- et triphosphate) par extraction en ligne sur colonne WAX couplée à la LC-MS/MS. La séparation analytique est réalisée sur colonne Hypercarb, sans agent de paire d'ions dans la phase mobile. Grâce à l'utilisation d'un triple quadripôle et une ionisation en mode positif, les nucléotides endogènes sont identifiés sans équivoque, y compris ceux possédant la même masse molaire. L'extraction et la séparation des nucléotides sont réalisées en 20 min. L'ensemble de la méthode, en comptant la ré- équilibration des colonnes, dure 37 min. La méthode de dosage a été validée pour les formes mono- et triphosphate et est applicable à des séries d'une vingtaine d'échantillons biologiques. D'autre part, dans une étude pré-analytique basée sur les plans d'expériences, nous avons comparé les conditions de préparation d'échantillons en vue du dosage de nucléotides intracellulaires dans 4 lignées cellulaires : 2 adhérentes (Messa et NCI-H292) et 2 en suspension (RL et L1210). Nous avons montré que les conditions pré-analytiques optimales dépendent de la lignée cellulaire soulignant ainsi l'importance de cette phase dans l'analyse des nucléotides. Enfin, l'expérience et les connaissances acquises lors du développement de la méthode de dosage des nucléotides ainsi que la large palette de molécules analysables avec cette méthode (nucléosides, nucléotides sucrés, autres métabolites), nous ont permis de développer des collaborations dans le domaine de la cancérologie avec différentes équipes de recherche. Par exemple, nous avons étudié l'implication des pools nucléotidiques dans le stress réplicatif induit par le stress oxydant et dans la reprogrammation cellulaire observée dans les cellules cancéreuses. Ainsi, les informations apportées par notre approche analytique, complémentaires des autres approches utilisées, ont montré l'implication des pools nucléotidiques dans la tumorigénèse. En conclusion, ce travail a permis de développer une technique analytique et de mettre en place une méthode de travail pour le dosage des nucléotides endogènes dans différents milieux biologiquesNucleotides, term including nucleoside mono-, di- and triphosphates, are endogenous compounds playing various roles in biology. They are components of nucleic acids, provide energy to metabolic reactions and act as carriers or second messenger. The study of endogenous nucleotides has become of great interest in physiological and pathological conditions. We developed a method for the quantification of endogenous nucleotides, using an on-line extraction on a WAX column coupled with LC-MS/MS. Analytical separation is performed on a Hypercarb column, without ion pairing agent in the mobile phase. The use of a triple quadrupole mass spectrometer following positive mode ionization allows the unambiguous identification of nucleotides presenting the same mass. Extraction and separation of nucleotides are achieved within 20 min and the method including re-equilibration of the two columns within 37 min. The method was validated for the quantification of nucleoside mono- and triphosphates, and could be applied to series of more than twenty biological samples. Secondly, in a study based on design of experiments, pre-analytical parameters influencing results of intracellular nucleotides were compared in four cell lines. We demonstrated that optimal pre-analytical parameters depend on cell lines. This clearly highlights the importance of pre- analytical conditions for the quantification of intracellular nucleotides to be as representative as possible of the real levels in cells. Then, thanks to experience acquired during the development and the validation of the analytical method, scientific collaborations have been established with several cancer research teams. For example, implication of nucleotide metabolism in replicative stress induced by oxidative stress or in the metabolic reprogramming in cancer cells was studied. Results obtained by our analytical approach were complementary to those obtained by other techniques. To conclude, our work consisted on the study of the entire workflow for the analysis of endogenous nucleotides in various biological sample