Analysis of metabolic mutants of Clostridium acetobutylicum by a global and quantitative systems biology approach

Clostridium acetobutylicum, une bactérie anaérobie stricte, à Gram positif et sporulante est maintenant considérée comme l'organisme modèle pour l'étude du métabolisme complexe desClostridies solvantogènes. Néanmoins, malgré de nombreuses études sur le sujet, les mécanismes moléculaires impliqués dans l'induction de solvantogénèse ne sont pas encore totalement compris. Une souche témoin et trois mutants métaboliques simples avec une délétion dans les phases codantes de gènes clés impliqués dans les formations d’acides / de solvants, à savoir ΔadhE1, ΔadhE2 et ΔbukΔptb300, ont été analysés par une approche globale à l'échelle du système pour mieux caractériser la régulation de la formation de solvant chez C. acetobutylicum d’un point de vue physiologique.Tout d'abord, la souche témoin ΔCA_C1502Δupp a été cultivée en chemostat limité en phosphate sous trois états métaboliques différents: l’acidogénèse, la solvantogénèse, et l'alcoologénèse. Les cultures ont été analysées par une approche de transcriptomique et de protéomique quantitative associée à une analyse fluxomique, basée sur un modèle l’échelle du génome, iCac967, développé au cours de la thèse. Cette étude a permis de mesurer le nombre de molécules d'ARNm par cellule pour tous les gènes dans les trois conditions métaboliques ainsi que le nombre de molécules de protéines cytosoliques par cellule pour environ 700 gènes dans au moins une des trois conditions de régime permanent.ΔadhE1 et ΔadhE2 ont été analysés ensemble et comparés à la souche témoin dans les mêmes conditions par une analyse transcriptomique et fluxomique globale. En condition solvantogène, seul le mutant ΔadhE1 présentait des changements significatifs montrant une diminution de la production de butanol et des changements d'expression au niveau transcriptionel dans de nombreux gènes. En particulier, adhE2 était surexprimé montrant qu’AdhE2 peut remplacer partiellement AdhE1 pour la production de butanol en solvantogénèse. En condition alcoologène, seul le mutant ΔadhE2 a montré des changements frappants dans l'expression des gènes et des flux métaboliques, avec notamment une perte totale de la production de butanol.Il est par conséquent démontré que AdhE2 est essentiel pour la production de butanol en alcoologénèse et que les flux métaboliques ont été réorientés vers la formation du butyrate. En condition acidogène, les flux métaboliques n'ont pas été significativement modifiés chez les deux mutants, mise à part la perte complète de la formation de butanol chez ΔadhE2, mais de manière surprenante des changements importants ont été observés, par analyse transcriptionnelle, dans l'expression de nombreux gènes. En outre, la plupart des gènes sur- ou sous-exprimés de manière significative dans cette condition physiologique, le sont pour les deux mutants.Le mutant ΔbukΔptb300 a également été analysé et comparé à la souche témoin dans les mêmes onditions par une analyse transcriptomique et fluxomique globale. En condition acidogène, le principal métabolite était le butanol et un nouveau composé est aussi produit qui a été identifiécomme étant du 2-hydroxy-valérate. En condition solvantogène, une augmentation de la production de butanol a été obtenue par rapport à la souche de contrôle et un rendement très élevé de formation de butanol a été atteint. En condition alcoologène, le produit principal était le lactate. En outre, au niveau transcriptionnel, adhE2 connu comme un gène exprimé spécifiquement en alcoologénèse, était étonnamment fortement exprimé dans tous les états métaboliques chez le mutant.Clostridium acetobutylicum, a Gram-positive, strictly anaerobic, spore-forming bacterium is now considered as the model organism for the study of the complex metabolism of solventogenic Clostridia. Nevertheless, the molecular mechanisms involved in the induction ofsolventogenesis are not totally understood. A control strain and three single metabolic mutants with in frame deletion in key genes involved in acid/solvent formations, namely ΔadhE1, ΔadhE2, and ΔbukΔptb300, were analyzed by a system scale approach to better characterize the regulation of solvent formation in C. acetobutylicum from a physiological point of view.First of all, the control strain ΔCA_C1502Δupp was cultured in phosphate-limited chemostat under three different metabolic states, acidogenesis, solventogenesis, and alcohologenesis. Thecultures were analyzed by a quantitative transciptomic and proteomic approach, and finally associated with a fluxomic analysis, based on the reconstructed genome-scale model, iCac967 developed during the thesis. This study provided the number of mRNA molecules per cell for all genes under the three metabolic conditions as well as the number of cytosolic protein molecules per cell for approximately 700 genes under at least one of the three steady-state conditions.ΔadhE1 and ΔadhE2 were analyzed together to be compared to the control strain under same conditions in transcriptomic and fluxomic level. Under solventogenesis, only ΔadhE1 mutant exhibited significant changes showing decreased butanol production and transcriptional expression changes in numerous genes. In particular, adhE2 was overexpressed; thus, AdhE2 can partially replace AdhE1 for butanol production under solventogenesis. Under alcohologenesis, only ΔadhE2 mutant exhibited striking changes in gene expression and metabolic fluxes, and butanol production was completely lost. Therefore, it was demonstratedthat AdhE2 is essential for butanol production and thus metabolic fluxes were redirected towardbutyrate formation. Under acidogenesis, metabolic fluxes were not significantly changed in both mutants except the complete loss of butanol formation in ΔadhE2, but numerous changes in gene expression were observed. Furthermore, most of the significantly up- or downregulated genes under this condition showed the same pattern of change in both mutants.ΔbukΔptb300 was also analyzed to be compared to the control strain under same conditions in transcriptomic and fluxomic level. Under acidogenic conditions the primary metabolite was butanol and a new compound, 2-hydroxy-valerate was produced while under solventogenesis, increased butanol production was obtained compared to control strain under same condition and a very high yield of butanol formation was reached. Under alcohologenesis, the major product was lactate. Furthermore, at the transcriptional level, adhE2 known as a gene specifically expressed in alcohologenesis, was surprisingly highly expressed in all the metabolic states in the mutant