Function and regulation of mycolic acids genes in mycobacteria

Mycobacterium tuberculosis (M.tb) l'agent étiologique de la tuberculose infecte un tiers de la population mondiale avec 9 millions de nouveaux cas et 1.5 millions de décès chaque année. La capacité de la bactérie à persister dans son hôte ainsi que l'apparition croissante de souches multi-résistantes voire totalement résistantes expliquent ces statistiques dramatiques. La découverte de nouveaux traitements à travers une meilleure connaissance de la physiologie et des programmes génétiques adaptatifs du pathogène est donc une priorité mondiale. M.tb est un bacille à Gram+ avec une enveloppe particulière caractérisée par une membrane externe (la mycomembrane) essentielle à sa viabilité et sa virulence. Cette membrane est constituée majoritairement d'acides mycoliques (AMs), des acides gras à très longues chaînes modifiés par l'introduction de groupements fonctionnels. Bien qu'à ce jour la biosynthèse des AMs est relativement bien caractérisée d'un point de vue biochimique, certaines données nécessitent d'être confirmées in vivo, de même qu'il existe peu d'information sur la régulation et la contribution des gènes de biosynthèse à la capacité adaptative des mycobactéries. Une trentaine de gènes sont impliqués dans la biosynthèse des AMs dont hadA, hadB et hadC codant pour une réaction de déshydratation essentielle. Il a été démontré biochimiquement que HadB porte l'activité catalytique et que HadA et HadC apportent la spécificité de substrats. Au cours de ma thèse, par une approche génétique, nous avons montré que seule HadB était essentielle à la viabilité mais que HadA et HadC bien que non essentielles jouaient un rôle majeur dans la physiologie, la capacité adaptative et la virulence des mycobactéries, en relation avec leur rôle dans la structure des AMs. Ces résultats avaient non seulement confirmé les données biochimiques quant au rôle de HadC dans la biosynthèse des AMs, mais également souligné l'intérêt d'une stratégie de lutte basée sur l'affaiblissement du fitness de M.tb, rendant ainsi le pathogène plus sensible aux traitements déjà existants ainsi qu'aux défenses naturelles de l'hôte. Une analyse phylogénétique couplée à une analyse expérimentale de l'expression des gènes nous a permis de retracer et de rationaliser le scénario évolutif qui a façonné le locus hadABC. En accord avec l'organisation génétique, j'ai ainsi montré que la carence en nutriments, un stress rencontré par la bactérie lors de l'infection, conduisait à la co-répression des gènes hadABC ainsi que de la plupart des gènes de biosynthèse des AMs avec des gènes impliqués dans le processus de traduction. Le potentiel de traduction est connu pour être contrôlé par la disponibilité en nutriments, à travers notamment la réponse stringente, une réponse adaptative universellement conservée chez les bactéries. Suite à ces résultats, un modèle a été proposé selon lequel au cours de la réponse stringente, les intermédiaires de synthèse des AMs, seraient détournés au profit de la synthèse de lipides alternatifs dont des lipides de stockage. L'analyse phylogénétique a également suggéré une relation fonctionnelle étroite entre l'activité des enzymes HadABC et des enzymes responsables de la modification des AMs. Afin d'avoir une vision intégrée de la régulation de la synthèse de la mycomembrane, nous avons analysé le rôle biologique du gène rv0081 codant pour un facteur de transcription global. Différentes approches systémiques suggéraient que Rv0081 jouerait un rôle central dans la capacité adaptative de M.tb en régulant de nombreux gènes impliqués dans différentes fonctions cellulaires dont les gènes hadABC. J'ai pu montrer qu'un mutant rv0081 était hypervirulent et que l'absence d'une régulation naturelle du gène affectait la capacité de survie de la bactérie à l'intérieur des macrophages.Mycobacterium tuberculosis (M.tb), the causative agent of tuberculosis infects one third of the world population with 9 million new cases and 1.5 million deaths each year. The capability of the bacteria to persist in its host and the emergence of multi- and totally-drug resistant strains explain these dramatic statistics. Therefore, the discovery of new drugs through a better understanding of the physiology and of the adaptive genetic programs of the pathogen is a priority. Mtb is a Gram + bacilli with an unusual cell envelope characterized by an outer membrane (the mycomembrane) essential to its viability and virulence. This membrane is mainly composed of mycolic acids (MAs), a class of very long chain fatty acids which are modified by the introduction of functional groups. To date the biosynthesis of MAs is biochemically well characterized, but some data need to be confirmed in vivo, likewise there is little information about the regulation and the contribution of biosynthesis genes in the adaptive capacity of mycobacteria. Around thirty genes are involved in the biosynthesis of MAs including hadA, hadB and hadC which are required for an essential dehydration reaction. It has been shown biochemically that HadB bears the catalytic activity and that HadA and HadC bring about the substrate specificity. In this study, using a genetic approach, we have shown that only HadB was essential to the viability but that the non-essential HadA and HadC proteins played a major role in the physiology, the adaptive capacity and the virulence of mycobacteria. These results have not only confirmed the biochemical data on the role of HadC in the biosynthesis of MAs, but have also underlined the relevance of a strategy based on weakening the fitness of Mtb, making the pathogen more susceptible to existing therapy as well as to the natural host defenses. Phylogenetic and experimental analyses of gene expression allowed us to rationalize the evolutionary scenario that has shaped the hadABC locus. In agreement with the genetic organization, I have shown that starvation, a stress experienced by the bacterium upon infection, resulted into the co-repression of the genes hadABC as well as most of the MAs biosynthetic genes with genes involved in the translation process. The translation potential is known to be controlled by nutrient avaibility, especially through the stringent response, an adaptive response widely conserved in bacteria. Following these results a model was proposed stating that during the stringent response, the MAs intermediate products would be redirected toward the synthesis of alternate lipids including storage lipids. Phylogenetic analysis also suggested a close functional relationship between the activity of HadABC proteins and the enzymes involved in the modification of MAs. In order to get an integrated picture of the regulation of the biosynthesis of the mycomembrane, we analyzed the biological role of rv0081, a gene encoding a transcription factor. Various comprehensive approaches suggested that Rv0081 plays a key role in M.tb adaptive capacity through the regulation of many genes involved in various cellular functions including the hadABC genes. In my PhD work I have shown that an rv0081 deleted strain was hypervirulent and that the inability of the bacteria to properly regulate the gene had prevented the bacteria to survive within macrophages