Catalytic mechanism of a new class of peptidoglycan transpeptidases

A l’instar des D,D-transpeptidases de la famille des protéines de liaison à la pénicilline (PLP), les L,D-transpeptidases catalysent la formation des ponts interpeptidiques du peptidoglycane. Chez un mutant de Enterococcus faecium, la totalité du peptidoglycane est synthétisée par les L,D-transpeptidases entrainant une résistance à toutes les β-lactamines à l’exception des carbapénèmes. Le peptidoglycane de Mycobacterium tuberculosis étant majoritairement synthétisé par des L,D-transpeptidases, ces enzymes sont une cible potentielle pour le développement de nouveaux traitements de la tuberculose. Les objectifs de cette thèse sont de comprendre la spécificité des L,D­transpeptidases pour les carbapénèmes et d’identifier les sites de fixation des précurseurs du peptidoglycane à ces enzymes. Les résultats montrent que l’oxyanion formé lors de l’attaque du cycle β-lactame des carbapénèmes par la cystéine active est stabilisé dans le site actif des L,D­transpeptidases. Cette stabilisation combinée à l’absence d’hydrolyse de l’acylenzyme conduisent à l’inactivation rapide, totale et irréversible des L,D­transpeptidases par les carbapénèmes. La structure de l’acylenzyme indique que ces propriétés sont indépendantes de la nature de la chaine latérale des antibiotiques qui pourrait être optimisée. La localisation de l’accepteur d’acyle dans la Poche II de Ldtfm ainsi que des interactions supplémentaires avec les chaines glycanes du peptidoglycane montrent que d’autres sites que celui ciblé par les β­lactamines, mimes du donneur d’acyle, sont des cibles pour le développement de nouveaux antibiotiques qui pourraient agir en synergie avec les β­lactamines.L,D-transpeptidases, as D,D-transpeptidases belonging to the penicillin-binding protein (PBP) family, catalyse the last cross-links step of peptidoglycan biosynthesis. The peptidoglycan of an Enterococcus faecium mutant is exclusively cross-linked by L,D-transpeptidases leading to resistance to all β-lactams except the carbapenems. Since peptidoglycan cross-links are predominantly synthesized by L,D-transpeptidases in Mycobacterium tuberculosis these enzymes are potential targets for chemotherapy of tuberculosis. The aims of the thesis are to identify the kinetic features that account for the specificity of L,D-transpeptidases for carbapenems and to characterise the binding sites for the peptidoglycan precursors in these enzymes. Our results show that the oxyanion resulting from nucleophilic attack of carbapebems by the catalytic cysteine is stabilized into the active site of L,D-transpeptidases. This stabilisation, combined to the absence of hydrolysis of the acylenzyme, leads to the rapid, total and irreversible inactivation of L,D-transpeptidases by carbapenems. Resolution of the acylenzyme structure shows that these kinetic features are independent from the carbapenem side chain that could be modified to optimize the antibiotics. The binding of the acyle acceptor has been identified in Pocket II of Ldtfm that is distinct from the binding site for β-lactams (Pocket I), which mimic the acyle donor. This site and additional peptidoglycan binding sites reveal additional targets for development of new antibiotics that might act in synergy with β-lactams