Contributions of biochemistry and proteomics to study cellular metabolism changes through two examples : amyloidogenesis of different ascomycete fungi proteins and characterization of the proteome of an invasive plant resistant to environmental stress

Un certain nombre de maladies neurodégénératives, comme la maladie de Creutzfeld-Jacob chez l'homme ou la maladie dite de "la vache folle" chez les bovins, sont dues au mauvais repliement d'une protéine cellulaire dite prion. Plusieurs protéines prions ont été identifiées chez des microorganismes comme Ure2p chez Saccharomyces cerevisiae ou HET-s chez Podospora anserina. Ces protéines sont non pathogènes pour l'homme et se comportent comme le prion de mammifères c'est à dire en s'assemblant également en fibres amyloïdes. Chez S. cerevisiae, la protéine Ure2p est associée au phénotype prion [URE3] et est agrégée dans ce type de cellule. Dans un premier temps, nous avons montré que les agrégats [URE3] obtenu in vivo étaient d'une nature différente des fibres amyloïdes produites in vitro. Dans un second temps, la technicité acquise au cours de l'étude biochimique d'Ure2p m'a permis d'aborder celle d'un orthologue, Ure2p de Saccharomyces paradoxus (Ure2p-Sp), qui n'est pas un prion "in vivo". Après avoir montré que les deux protéines sous forme soluble présentent les mêmes caractéristiques biochimiques, je montre qu'elles possèdent la même propension à former des fibres amyloïdes. Dans le cadre de cette étude nous montrons également que ces fibres sont infectieuses laissant penser qu'in vivo cette incapacité de la protéine Ure2p-Sp à basculer sous forme prion est plutôt due à une défaillance du mécanisme de propagation des prions plutôt qu'à une différence de la structure amyloïde proprement dite. Enfin, nous avons pu montrer qu'il était possible de transformer une protéine amyloïde non toxique en une protéine toxique en ne changeant que quelques acides aminés. En poursuivant cette étude par une étude in vitro, j'ai également pu observer que la protéine toxique s'organisait in vitro en de courtes fibres amyloïdes qui pouvaient mimer les intermédiaires responsables de la toxicité au cours des maladies neurodégénératives. Si dans cette première partie l'apport de la biochimie dans l'étude ciblée de différentes protéines amyloïdes de champignons ascomycètes est évident, l'étude des protéines peut également se faire par une approche biochimique globale sans a priori comme dans l'étude de la réponse protéique d'une plante à un stress environnemental. Grâce au séquençage des génomes, la biochimie post-génomique connait un essor exceptionnel et permet de mettre en évidence de nouvelles protéines dans le cadre d'études fonctionnelles. Dans ce but, j'ai mis en oeuvre une technique de protéomique différentielle : l'électrophorèse bidimensionnelle de type DiGE (Differential in-Gel Electrophoresis) dans le cadre de l'étude du protéome d'une plante invasive, le solidage Solidago canadensis, soumise à un stress d'origine anthropique. Cette étude protéomique vient en complément d'une étude phytosociologique des plantes capables de coloniser un sol très dégradé mais aussi de données de biodiversité, croissance et de mesures de la réponse anti-oxydante de ces végétaux. Cette analyse a révélé que sur des sols pollués, le solidage parvient non seulement à produire l'énergie nécessaire à sa croissance mais il parvient également à synthétiser les intermédiaires de biosynthèse du glutathion et des phytochélatines. Ainsi, le solidage est capable de s'adapter à ce milieu ce qui lui permet d'être tolérant à la pollution. Mes premiers résultats de biochimie post-génomique offrent de nouvelles bases pour la compréhension des mécanismes de tolérance au milieu de certaines plantes permettant le développement de technologies innovantes de phytorémédiation afin de restaurer les sols polluésA number of neurodegenerative illnesses such as Creutzfeld-Jacob disease in humans or the disease known as mad cow disease in bovine, are due to misfolding of a cellular protein called prion. These proteins are not pathogenic for human and can form amyloid fibers like mammalian prion. They are therefore a useful tool to study molecular events responsible for the emergence and propagation of prions. In S. cerevisiae, the Ure2p protein is associated with [URE3] prion phenotype and is aggregated in this cell. Initially, I developed the conditions to characterize Ure2p amyloid fibers by proteolysis and we showed that [URE3] aggregates obtained in vivo were different than amyloid fibers produced in vitro. In a second phase, the technicity acquired during the biochemical study of Ure2p allowed me to approach the study of an ortholog, Saccharomyces paradoxus Ure2p (Ure2p-Sp), which is not an "in vivo" prion. After showing that soluble forms of the two proteins have the same biochemical characteristics, I show that they have the same propensity to form amyloid fibers. In this study we show that these fibers are infectious in vivo, suggesting that the incapacity of Ure2p-Sp protein to switch into a prion form is rather due to a failure in prion propagation mechanism rather than differences in amyloid structure itself.Then using all technologies that I introduced in the laboratory, I studied the relationship between amyloid structure and toxicity in S. cerevisiae. We showed that it was possible to transform a non-toxic amyloid protein in a toxic form by changing only a few numbers of amino acids. An in vitro study has also shown that the toxic protein was organized into short amyloid fibers that could mimic the intermediates responsible for toxicity in neurodegenerative diseases.The last chapter of this manuscript focuses on research that I developed in the Laboratory of Ecotoxicology Interactions,Biodiversity, Ecosystems, Metz. Within this laboratory, we aim at identifying effects of disturbances and physico-chemical analysis of the mechanisms involved at different scales of observation, from organisms to ecosystems.Progress in genomes sequencing allows an exceptional development in post-genomic biochemistry and can highlight new proteins through functional studies. In order to better understand molecular events responsible for these responses, I introduce a differential technique of proteomics: a DiGE two-dimensional electrophoresis (Differential In-Gel Electrophoresis). I developed this technics in a proteome study of an invasive plant, the goldenrod Solidago canadensis, under metal stress. This proteomic study supplements a phyto-sociological study of plants competent in colonizing a very poor soil but also of biodiversity data, growth and measures of the antioxidant response of these plants. This analysis revealed that in polluted soils, the goldenrod achieves not only to produce energy for its growth but it also achieves to biosynthesize intermediates of glutathion and phytochelatins. Thus, the goldenrod is able to adapt to its environment, which allows it to be tolerant to pollution. My first results of post-genomic biochemistry provide new bases for understanding the molecular mechanisms behind environmental tolerances. These studies may help us to identify the most adapted plants to these environments and why they are. They may help us to understand the effects of these pollutants and allow the development of innovative technologies for phytoremediation to restore polluted soil