Development of liposomal vectors functionalized by Annexin5 derived proteins and encapsulating imaging compounds

Ce sujet se situe dans le cadre de la mise au point de systèmes de délivrance de composés thérapeutiques ou d’imagerie, c’est à dire d’objets qui doivent transporter des composés dans un organisme et posséder une spécificité pour une zone à traiter ou à imager. Les objectifs de mon travail de thèse étaient l’addition d’une spécificité aux liposomes grâce à la liaison ou l’utilisation de protéines dérivées de l’Annexine 5 (Anx5) et l’encapsulation dans l’espace interne des vésicules de composés permettant le suivi de ces vecteurs. Nous avons tout d’abord mis au point des liposomes pour lesquels l’Anx5 est couplée à l’extrémité d’un lipide-PEG et sert d’élément d’adressage vers des cellules en apoptose. La liaison Anx5 / lipide-PEG a été caractérisée par SDS-PAGE de façon à contrôler la densité de ligand en surface des vésicules. L’influence de cette densité de ligand sur l’efficacité de liaison des vecteurs à des membranes cibles et sur l’agrégation des vésicules a été évaluée par QCM-D et DLS. Il apparait qu’une densité de 60 Anx5 / liposome est un optimum vis-à-vis de ces facteurs. Enfin l’encapsulation de fluorophores a permis d’imager l’interaction des liposomes-Anx5 avec des cellules en apoptose. Pour former des magnétoliposomes nous avons mis au point et caractérisé l’encapsulation de particules d’oxyde de fer dans des liposomes neutres et anioniques. La procédure d’encapsulation passive ainsi que l’influence de la charge membranaire négative et la stabilité des magnétoliposomes ont été évaluées. Le nombre de particules d’oxyde de fer par vésicule a été déterminé par dosages et l’aspect des liposomes a été examiné par cryomicroscopie électronique à transmission. Un maximum d’environ 50 particules par liposome a été encapsulé dans des vésicules de 100nm de diamètre. La présence de lipides anioniques limite l’efficacité d’encapsulation et favorise la déstabilisation des magnétoliposomes. Enfin, la liaison d’anticorps en surface des liposomes grâce à l’Anx5ZZ a été caractérisée et optimisée de façon à utiliser ces anticorps comme éléments d’adressage pour cibler deux pathologies : l’athérosclérose et l’inflammation. La composition lipidique a été optimisée pour encapsuler de façon stable des fluorophores tout en liant des Anx5. Les expériences de caractérisation de la fonctionnalisation par DLS et FRET nous ont conduits à choisir une séquence pour l’association des anticorps qui consiste a associer les anticorps aux Anx5ZZ dans un premier temps à lier ce complexe en surface des liposomes. Deux anticorps ont été utilisés pour vérifier les capacités d’adressage des vecteurs vers des cibles biologiques, tout d’abord ex vivo sur des modèles de plaques d’athérome puis ex et in vivo sur des rats présentant des zones d’inflammation. L’ensemble de ces travaux ont donc consistés à mettre au point des liposomes fonctionnalisés avec des dérivés d’Anx5 et encapsulant des éléments dans l’espace interne des vésicules. Ces vecteurs ont étés utilisés pour imager des cibles biologiques.This subject is in the framework of drug or imaging agent delivery system. This object must carry compound in an organism and selectively recognize a target area. The aims of my work were to add a targeting element to liposomes by use of Anx5 derivative and to encapsulate imaging compound inside the aqueous inner space. First we designed Anx5-bearing liposomes with the Anx5 protein covalently linked at the distal end of a PEG-lipid and used as targeting element. Anx5 conjugation was monitored by SDS-PAGE in order to control Anx5 density on the liposome surface. The influence of ligand density on the efficiency of binding to target membranes and on solutions dispersity was assessed by QCM-D and DLS. A density of 60 Anx5 / liposomes ensure the best target recognition efficiency and dispersity. Finally fluorescent dyes encapsulation was used to image the interaction between Anx5 bearing liposomes and apoptotic cells. To prepare magnetoliposomes we have synthesized and characterized the encapsulation of iron oxide nanoparticle inside neutral and anionic liposomes. The passive encapsulation procedure, the influence of the negative charge and the magnetoliposome stability were evaluated. The number of particle / vesicle was assayed and the liposomes aspect was examined using cryoelectron microscopy. An average of 50 particles / liposomes was encapsulated inside 100nm vesicles. Anionic lipids limit the encapsulation efficiency and promote liposomes destabilization. Finally the use of Anx5ZZ to anchor antibodies on the liposomes surface was characterized and optimized to use antibodies as homing device to target two diseases: atherosclerosis and inflammation. Lipid composition was optimized to stably entrap fluorescent dyes while Anx5 are bound on the membrane. To functionalize the vector, DLS and FRET experiment leads us to choose a sequence that consists in associating antibodies to the Anx5ZZ in a first time and then binding this complex on the liposome surface. Two antibodies were used to address the liposome toward biological targets, ex vivo on atherosclerosis models and in vivo on rats bearing inflammation areas