Streptococcus thermophilus and Lactococcus lactis : lactic acid bacteria as tools for the production of bioactive peptides? : Effect of proteolytic system on the stability of peptides and heterologous production of an anxiolytic peptide, [alpha]-casozepine

La conception de nouveaux produits laitiers fermentés fonctionnalisés avec les peptides bioactifs est l'une des stratégies prometteuses pour le développement d'aliments fonctionnels. L'objectif de cette thèse s'inscrit ainsi dans une démarche de production d'un lait fermenté contenant un peptide anxiolytique, l'alpha-casozépine (alpha-CZP ; f91-100 de la CN-alpha s1 bovine) ou du fragment plus court (f91-97). Dans un premier temps, nous avons étudié la stabilité des peptides bioactifs vis-à-vis des souches ayant le phénotype PrtS+ (LMD-9) et PrtS- (CNRZ1066) de S. thermophilus. Il s'est avéré que les deux souches sont capables d'hydrolyser le peptide en fragments plus courts par l'activité peptidasique de surface. Il a été vérifié que l'hydrolyse n'est due ni aux peptidases intracellulaires issues d'une éventuelle lyse cellulaire ni à la protéase chaperonne HtrA. Les activités de type amino-, X-prolyl dipeptidyl-, carboxy-peptidases et peptidyl dipeptidase de surface ont été mises en évidence. L'ajout de peptides bioactifs dans des laits fermentés nécessite donc la caractérisation préalable du potentiel protéolytique des bactéries lactiques. Afin de n'ajouter qu'un type de peptides et non pas une fraction peptidique, nous avons exprimé de manière hétérologue l'alpha-CZP sous forme multimérique chez L. lactis en utilisant le système d'induction NICE. Il a été révélé par le test ELISA qu'une petite quantité d'alpha-CZP multimérique a été produite par les cellules induites mais également non induites par la nisine. Le ralentissement important de la croissance des cellules de L. lactis recombinante induites par la nisine suggère que le multimère peptidique a des effets toxiques sur les cellulesThe designing of novel fermented milk products functionalized with bioactive peptides is one of the promising strategies to develop functional foods. The objective of the thesis is thus the development of fermented milks comprising of an anxiolytic peptide, alpha-casozepine (f91-100 of bovine alpha s1 CN) or its shorter fragment (f91 97). Firstly, we studied the stability of different bioactive peptides towards two strains, with PrtS+ (LMD¬9) and PrtS- (CNRZ1066) phenotypes, of S. thermophilus, a starter bacterium widely used for the manufacture of yogurt. It was revealed that both strains hydrolysed the peptides into shorter fragments by surface peptidases. The hydrolysis was neither due to intracellular peptidases eventually released from cell lysis nor to extracellular chaperone protease HtrA, since mutant LMD-9-deltahtrA also showed the same type of hydrolysis. Aminopeptidase, X-prolyl dipeptidyl peptidase, peptidyl dipeptidase and carboxypeptidase activities associated to the cell-surface of both strains were observed. Therefore, addition of bioactive peptides in fermented milks requires well prior characterization of the proteolytic potential of lactic acid bacteria. Finally, in order to add only one type of peptides instead of a peptide fraction, we expressed heterologously alpha-CZP in multimeric form in L. lactis using NICE system. It was revealed by ELISA test that a small quantity of recombinant alpha-CZP multimer was produced by both nisin-induced as well as non-induced cells. The significant decrease in the growth of nisin-induced recombinant L. lactis suggests that the peptide multimer has toxic effects on the cell