Akt/mTOR pathways : Therapeutic target in experimental pulmonary arterial hypertension.

Les travaux de la thèse portent sur l'implication de la voie de signalisation Akt (sérine/thréonine kinase Akt) et mTOR (mammalian target of rapamycin) dans la physiopathologie de l'hypertension artérielle pulmonaire (HTAP) expérimentale. L'HTAP résulte d'une prolifération exagérée des cellules constitutives des vaisseaux pulmonaires, principalement les cellules musculaires lisses artérielles pulmonaires (CML-AP). De nombreux effecteurs biologiques et physiques préalablement identifiés agissent sur les CML-AP et participent à l'hyperplasie de celles-ci. Nous montrons que ces nombreux effecteurs convergent vers une voie de signalisation intracellulaire commune, la voie Akt/mTOR, qui de fait représente une cible thérapeutique pour le traitement de l'HTAP, et pourrait conditionner l'hyperplasie des CML-AP. mTOR est présent dans la cellule sous forme de deux complexes, mTORC1 et mTORC2, qui phosphorylent des substrats variés contrôlant la prolifération cellulaire. Les effecteurs de mTORC1 incluent les S6 kinases (S6K1 and S6K2) et les "eIF4E-binding proteins" (4EBP) alors que mTORC2 active la sérine/thréonine kinase Akt et parmi les kinases sous-jacentes, la kinase GSK3. La première étude est consacrée à l'évaluation des effets des inhibiteurs de protéases du VIH (ritonavir, amprenavir, nelfinavir) sur la progression de HTAP expérimentale, induite par la monocrotaline ou l'hypoxie. Nous montrons que ces deux formes d'HTAP sont associées à une activation de la voie Akt/mTOR dans les artères pulmonaires. Les traitements respectifs par les trois inhibiteurs des protéases du VIH durant 3 semaines induisent une réversibilité de l'HTAP, de l'hypertrophie ventriculaire droite et du remodelage des vaisseaux pulmonaires, de même qu'une inhibition de la phosphorylation d'Akt, de S6K et de GSK3. La prolifération des CML-AP induite par le PDGF ou le SVF 5%, associée à une augmentation de p-Akt et p-GSK3, est également bloquée par les inhibiteurs des protéases, de façon similaire et non additive à celle d'inhibiteurs spécifiques de la PI3 kinase et de GSK3. La conclusion est que ces traitements antirétroviraux inihibent la progression de l'HTAP en inhibant la voir Akt/mTOR dans les CML-AP. Cette proposition permettrait d'expliquer l'effet suspecté en clinique des traitements antirétroviraux sur l'HTAP compliquant l'infection par le VIH.Dans la seconde étude, nous montrons que les CML-AP en culture prélevées à partir de rats ayant développé une HTAP induite par la monocrotaline proliférent de façon exagérée en comparaison avec les cellules de rats témoins. Ce phénotype prolifératif est observé en présence de nombreux facteurs mitogènes parmi lesquels le SVF 5%, le PDGF, la sérotonine ou 5-HT, l'IGF1 ou l'IL1-beta, et est associé à une activation des substrats de mTORC1 et mTORC2. Le traitement in vitro par la rapamycine des CML-AP de rats avec HTAP établie permet d'inhiber la prolifération de ces cellules et de bloquer à la fois mTORC1 et mTORC2. De même, le traitement par la rapamycine de rats porteurs de l'HTAP préétablie pendant une semaine permet de normaliser la prolifération des CML-AP in vitro et in vivo et d'inhiber mTORC1 et mTORC2, effets non observés par l'Imatinib ou la Fluoxetine. De plus, le traitement des rats par la rapamycine prévient ou corrige l'HTAP induite par la monocrotaline de façon plus importante que l'Imatinib ou la Fluoxétine.Ces résultats indiquent donc que l'activation de la voie Akt/mTOR, très étroitement associée au développement de l'HTAP expérimentale, pourrait expliquer le phénotype prolifératif anormal des CML-AP inhérent à la pathologie, et ainsi représenter une cible thérapeutique de choix pour le traitement de l'HTAP humaine.The major objectives of research described in this thesis is focused on the cell signaling pathway of Akt (serine/threonine kinase Akt) and mTOR (mammalian target of rapamycin) in the patho-physiology of experimental pulmonary arterial hypertension (PAH). PAH occurs as a result ofhyperplasia of the components of pulmonary vessels, principally the pulmonary arterial smooth muscle cells (PA-SMCs). Numerous previously identified biological and physical effectors act on the PA-SMCs and participate in PA-SMC hyperplasia. Here we show studied that these different effectors converge into a common intracellular signaling pathway, Akt/mTOR signaling pathway, which represents actually a therapeutic target for PAH treatment, and could be involved in the hyperplasia of PA-SMCs. In cells mTOR, is presented in the form of two complexes, mTORC1 and mTORC2, which phosphorylate various substrates controlling the cellular proliferation. The effectors of mTORC1 include the S6 kinases (S6K1 and S6K2) and eIF4E-binding proteins (4EBP), meanwhile mTORC2 activates the serine/threonine kinase Akt and the underlying kinases, e.g. GSK3 kinase.The first study is devoted to evaluate the effects of the protease inhibitors of HIV (ritonavir, amprenavir, nelfinavir) on experimental PAH development induced by monocrotaline or hypoxia. We studied that the two forms of PAH are associated with an activation of Akt/mTOR signaling pathway in pulmonary arteries. The treatment by the three protease inhibitors of HIV during 3 weeks causes reversibility in experimental PAH with decreased right ventricular hypertrophy and pulmonary vascular remodeling as well as inhibition of phosphorylation of Akt, S6K and GSK3. The proliferation of PA-SMCs stimulated by PDGF or FCS 5%, which is associated with an increased p-Akt and p-GSK3, is also blocked by the proteases inhibitors, in a similar and non additive way like the specific inhibitors of PI3 kinase and GSK3. We conclude that the antiretroviral treatments significantly inhibits PAH development by inhibiting Akt/mTOR signaling pathway in PA-SMCs. This proposition allows explaining the effect of antiretroviral treatments of PAH accompanied with HIV in patients.In the second study, we studied that the cultured PA-SMCs extracted from the rats with monocrotaline induced-PAH(MCT-PAH) proliferates faster as compared to control. This proliferative phenotype is observed in the presence of different mitogenic factors including FCS 5%, PDGF, 5-HT, IGF1 or IL-1β, and is associated with an activation of the substrates of mTORC1 and mTORC2. Treatment with rapamycin in the PA-SMCs extracted from the rats with PAH in vitro inhibits the proliferation and also blocks the activation of mTORC1 and mTORC2. The treatment by rapamycin in the rats with PAH during one week allows normalizing the proliferation of PA-SMCs in vitro and inhibiting the activation of mTORC1 and mTORC2 in vivo. These effects were not observed when treated with imatinib or fluoxetine. Moreover, treatment with rapamycin prevents or reverse MCT induced PAH more significantly than that by imatinib or fluoxetine.These results indicate that the activation of Akt/mTOR signaling pathway isclosely related to experimental PAH development, which can explain the abnormal proliferative phenotype of PA-SMCs involved in the patho-physiology of PAH, and represent a therapeutic target for the treatment of PAH in human