Study of multidrug resistance mechanisms by efflux in pathogenic Burkholderia

Burkholderia pseudomallei et Burkholderia mallei sont respectivement les agents biologiques responsables de la mélioïdose et de la morve. Pour déterminer si les échecs thérapeutiques étaient dus à l'émergence d'une résistance acquise durant le traitement antibiotique, nous avons sélectionné des souches de Burkholderia thailandensis, modèle d'étude, B. pseudomallei et B. mallei, avec différents antibiotiques : le chloramphénicol, la doxycycline et le triméthoprime-sulfaméthoxazole. Les Burkholderia ont montré qu'elles étaient capables de développer une multirésistance in vitro en réponse à chaque antibiotique utilisé dans le traitement oral de la mélioïdose ou de la morve. Pour comprendre les mécanismes de résistance impliqués, nous avons étudié les aspects moléculaires et génétiques de la résistance chez B. thailandensis par des méthodes protéomiques et transcriptomiques. Nous avons développé une méthode pour quantifier l'expression des gènes de pompes d'efflux par RT-PCR quantitative après normalisation sur plusieurs gènes de référence. Ces méthodes nous ont permis d'identifier la surproduction séquentielle de trois pompes d'efflux de type RND : BpeAB-OprB, AmrAB-OprA et BpeEF-OprC, toutes induites par le chloramphénicol ou la doxycycline chez les souches multirésistantes. L'étude de mutants déficients en pompe d'efflux nous a permis de mieux appréhender les relations étroites entre ces trois pompes et a confirmé que l'efflux actif était le principal mécanisme impliqué cette résistance induite.Burkholderia pseudomallei and Burkholderia mallei are respectively the causative agents of melioidosis and glanders. To determine whether treatment failures were due to the emergence of acquired resistance during antibiotic treatment, we selected strains of B. pseudomallei, B. mallei, and Burkholderia thailandensis, used as a study model of these two pathogenic bacteria, with structurally unrelated antibiotics: chloramphenicol, doxycycline and trimethoprim-sulfamethoxazole. We showed that Burkholderia were able to develop multidrug resistance in vitro in response to each of theses antibiotics used in the oral treatment of melioidosis and glanders. To understand the resistance mechanisms involved, we studied the molecular and genetic aspects of resistance in B. thailandensis by proteomic and transcriptomic methods. We have developed a method to quantify efflux pumps gene expression by quantitative RT-PCR after normalization with several reference genes. These methods allowed us to identify sequential overproduction of three RND efflux pumps: BpeAB-OprB, AmrAB-OprA and BpeEF-OprC, all induced by chloramphenicol or doxycycline in multiresistant strains. The study of mutants respectively defective in one of these efflux pumps has allowed us to better understand the close relationship between these three pumps and confirmed that active efflux acted as a major mechanism involved in the induced resistance