Pathogénomique du champignon phytopathogène Leptosphaeria maculans : exploitation d’une large collection de mutants ADN-T pour comprendre les mécanismes d’intégration de l’ADN-T et identifier des déterminants du pouvoir pathogène

Leptosphaeria maculans est un Dothideomycète phytopathogène capable d’alterner des modes de vie saprophyte, hemibiotrophe endophyte et nécrotrophe durant son cycle infectieux sur le colza. Afin de comprendre cette plasticité infectieuse, une mutagenèse aléatoire à grande échelle par ATMT a permis de générer une collection de 5000 transformants. L’objectif principal de cette thèse était d’exploiter cette collection en prenant avantage de la disponibilité d’outils de génomique, pour, d’une part, comprendre les mécanismes d’intégration de l’ADN-T dans le génome, et d’autre part, identifier des déterminants du pouvoir pathogène ciblés par l’ADN-T dans des mutants affectés dans leur capacité infectieuse. Une analyse systématique de 318 pieds d’insertion a été réalisée dans le but de d’évaluer les caractéristiques de l’insertion de l’ADN-T. Ce dernier est fréquemment inséré dans les régions actives riches en gènes, et favorise des gènes impliqués dans des processus biologiques indicatifs d’une conidie germante. Un biais marqué des insertions en faveur des régions régulatrices est observé ainsi qu’une corrélation entre la densité des insertions et le skew CG près du site d’initiation de la transcription. Ces observations sont cohérentes avec le modèle de ciblage intranucléaire de l’ADN-T. Enfin, l’existence de micro-homologies entre le site de pré-insertion et la bordure gauche de l’ADN-T indique une intégration par voie de recombinaison homologue (HR) et/ou microhomologue (MMEJ). Une approche multicritère a été utilisée pour caractériser cette collection. Un test d’inoculation a permis d’identifier 166 mutants altérés dans leur pouvoir pathogène. La validation génétique de la co-ségrégation entre le phénotype altéré et la présence de l’ADN-T indique que 44% des mutants montrant un déterminisme monogénique de l’altération sont effectivement étiquetés. Parmi les mutants altérés, 35 ont été analysé pour : (i) le phénotype de croissance en conditions usuelles de culture et en réponse aux stress oxydatif, UV et nutritif, (ii) le lien entre altération de la germination et pouvoir pathogène. Les gènes affectés par l’intégration de l’ADN-T, ont été identifié et analysé dans la souche sauvage à l’aide de données de transcriptomique. Ces cribles ont permis de décomposer le phénotype d’altération in planta en plusieurs phénotypes in vitro. Le plus fréquemment, les mutants ne sont pas altérés dans leur in vitro croissance, mais la plupart sont sensibles aux ROS. Les analyses d’expression au cours de l’infection indiquent que les gènes codant pour des effecteurs et ceux impliqués dans la détoxification des ROS, ont des dynamiques d’expression inverses et bi-phasiques, en lien avec le style de vie hemibiotrophe de L. maculans. Les 42 gènes ciblés par l’ADN-T dans ces mutants ont été identifiés et leur fonction putative disséquée par bioinformatique et transcriptomique. Au final, nous avons identifié six mutants d’intérêt pour une caractérisation fonctionnelle. Deux de ceux-ci deux ont atteint un niveau de caractérisation suffisant pour l’émission d’une hypothèse de travail. Dans le mutant µ1165, l’ADN-T cible un gène codant pour une protéine ribosomale S17 (LmRPS17), dont la régulation dépendrait de la voie de signalisation du complex TORC1. Nos résultats préliminaires suggèrent, d’une part, que TORC1 est une cible potentielle de LmRPS17 et, d’autre part, que la phase biotrophe de l’infection chez L. maculans est probablement régulée par TORC1 via l’enzyme de détoxication des ROS SOD2. Dans le mutant µ444, l’ADN-T cible un gène codant pour un élément rétroviral putatif LmHYP1, largement conservé parmi les ascomycètes. Nos résultats suggèrent que LmHYP1 interviendrait dans la régulation de gènes impliqués dans le pouvoir pathogène, via la production de petits ARN interférents issus hypothétiquement du clivage de son ARN messager par la machinerie de défense anti-rétrovirale. La validation de ces deux hypothèses est en cours au laboratoire.The Dothideomycete phytopathogen Leptosphaeria maculans is capable to alternate saprophytic, hemibiotrophic, endophytic and necrotrophic life styles during a single infectious cycle on its host plant, Brassica napus. However, little is known about the determinants of such plasticity. As part of a large-scale insertional mutagenesis project aiming at the discovery of pathogenicity factors a collection 5000 transformants has been generated by ATMT. The main objective of my PhD was to take advantage of “omics” to extract biological value from L. maculans mutants collection for a better understanding of T-DNA integration features and further identification of pathogenesis determinants in this fungus. A systematic analysis of 318 T-DNA tags was performed in a large collection of transformants in order to evaluate the features of T-DNA integration in its particular TE-rich compartmentalized genome. The T-DNA integration was mainly targeted to gene-rich, transcriptionally active regions, and favored biological processes that are consistent with the physiological status of a germinating conidia. In addition, T-DNA integration was strongly biased towards regulatory regions, and mainly promoters. Consistently with the T-DNA intranuclear targeting model, the density of T-DNA insertion correlated with CG skew near the transcription initiation site. The existence of microhomologies between promoter sequences and the T-DNA LB flanking sequence was also consistent with T-DNA integration to host DNA mediated by homologous recombination and/or the microhomology-mediated end joining pathways. Based on this data, a multi-criteria approach was used to draw the more possible information from this collection by identifying all 166 mutants reliably affected in pathogenicity, and expanding the genetic analysis. Considering single-gene segregation of the pathogenicity phenotype, our data indicate a 44% ratio of actual tagging. In parallel, for a subset of 35 isolates of the collection, we (i) described growth patterns in regular culture conditions or in response to oxidative, UV or starvation stresses, (ii) evaluated the link between altered germination and pathogenicity, (iii) identified and annotated the genes putatively affected by the T-DNA integration, and (iv) analyzed kinetics of expression of these genes in the WT isolate using available microarrays. Our results showed that pathogenicity alteration phenotype could be broken down into a pattern of phenotypes in vitro including growth, germination defect and susceptibilities to oxidative burst, starvation and UV stresses. Our results showed that most of these mutants were not altered in axenic growth but showed enhanced sensitivity to reactive oxygen species (ROS). Furthermore, our results showed that effectors and ROS scavengers have inverted dynamics during plant infection, consistently with the biphasic hemibiotrophic growth of L. maculans. Also, 42 genes targeted by the T-DNA in these mutants were recovered and dissected. This catalogue allowed us to identify a series of promising mutants for further functional studies. Based on this screening, six mutants were subjected to further analyses but only two reached sufficient advance for hypothesis building. In mutant µ1165, the T-DNA targeted a ribosomal protein S17 (LmRPS17), a downstream component of target of rapamycin complex 1 (TORC1) pathway. Our preliminary results suggested that TORC1 is a potential a target of LmRPS17. Also, biotrophic growth is probably tuned by TORC1 via Super oxide dismutase 2 (SOD2). In mutant µ444, the T-DNA targeted a retroviral-like element LmHyp1 widely conserved among ascomycetes. Our results suggest that LmHyp1 probably acts as a regulatory element during plant infection as its cleavage by the antiretroviral defences is hypothesized to generate siRNAs that silences distant genes. Work on these mutants is in progress