Molecular bases of clonal variation from grape (Vitis Vinifera L.)

L'exploitation de la variation clonale est une des voies d'amélioration utilisée chez un grand nombre de plantes d'intérêts agronomiques telles que la pomme de terre, le café et la vigne. En effet, après plusieurs cycles de reproduction végétative, des caractéristiques agronomiques stables apparaissent donnant naissance à une diversité phénotypique remarquable, appelée « diversité clonale ». Chez la vigne, cette diversité clonale est d'une importance majeure pour les viticulteurs puisqu'elle permet une amélioration variétale sans changer d'identité de cépage en conformité avec la réglementation fixée par Appellations d'Origine Protégée. L'hypothèse la plus parcimonieuse expliquant cette diversité phénotypique clonale est l'accumulation de mutations somatiques au cours des cycles de reproduction végétative. L'objectif de cette thèse a été de dresser un panorama le plus exhaustif possible des différents polymorphismes moléculaires entre les génomes de plusieurs clones. Dans un premier temps trois clones de Pinot ont été séquencés par la technique 454 GS-FLX puis dans un second temps 11 clones de quatre cépages ont été séquencés la technique Illumina HiSeq 2000. Afin d'analyser la grande quantité de données obtenues, nous avons construit un pipeline d'analyse (Bacchus pipeline) permettant d'identifier tous les types de polymorphismes moléculaires entre les différents génomes.Nos résultats permettent, pour la première fois un inventaire exhaustif des polymorphismes moléculaires dans un contexte multiplication végétatif. L'ensemble des mutations polymorphes entre deux clones a pu être identifié, SNPs, indels (2,5 SNPs et 11,5 indels par Mb en moyenne) ainsi que des variations d'ordre structural (larges insertions ou délétions) représentant la classe la plus fréquente (129 évènements par Mb entre deux clones en moyenne). Afin d'évaluer le polymorphisme d'insertion généré par ces éléments nous en avons étudié quatre par une approche S-SAP sur plusieurs niveaux de diversité (inter-espèces, inter-cépages, inter-clones et entre plusieurs tissus d'un même individu). L'analyse phylogénétique au niveau des espèces est conforme à celle réalisée avec d'autres types de marqueurs moléculaires (SSR, SNP). Cependant, une forte instabilité de ces insertions a été confirmée entre les clones et entre les tissus d'un même d'individu. L'identification des clones par une méthodologie moléculaire serait d'une grande importance pour la filère. Pour cet objectif, nos résultats indiquent que les mutations de types SNP et petits indels qui sont certes moins fréquentes que les variations structurales mais qui sont plus stables semblent plus pertinentes pour la mise en place d'une méthodologie d'identification des clonesClonal variation is considered as an effective contribution to breeding programs of vegetatively propagated species with major agronomical interest such as banana, potato, coffee and grape. Indeed, after several propagation cycles, stable and heritable phenotypic variations appear giving rise to a phenotypic variation termed “clonal diversity”. This clonal diversity is very important for wine-growers because it allows preserving cultivars identity in the strict respect of Appellation (A.O.P) wines specifications The most parsimonious hypothesis explaining clonal phenotypic diversity is the accumulation of somatic mutations. The objective of my thesis was to provide a broad description of molecular polymorphisms in the context of vegetative propagation. Three clones were first sequenced by 454 GS-FLX technology and eleven clones were then sequenced with Illumina Hiseq2000 technique. To analyse the high quantity of data obtained, we built a pipeline (Bacchus pipeline) allowing the identification of all existing molecular polymorphisms between different genomes.All polymorphism types were observed: indels and SNPs which have a low polymorphism frequency (2.5 SNPs and 11.5 indels per Mb between two clones in average) and structural variations (large insertions or deletions) which have a high polymorphism frequency (129 per Mb between two clones in average) but are unstable. To evaluate stability and polymorphism level of these transposable elements, we have studied 4 elements using S-SAP method at different diversity levels (inter-species, inter-cultivars, inter-clones and between organs/tissues of a single individual). Our interspecific phylogenetic analysis is similar to other phylogenies performed with SSR or SNPs markers. However, we confirm the high instability of these elements between clones and between tissues in single individuals.Clone identification through molecular methods would be of high significance for the wine industry. SNP or small indels mutations are less frequent but more stable than structural variation and could be used for accurate clone identification