Development of new molecular methods for typing and study of antibiotic susceptibility of Chlamydia trachomatis

Chlamydia trachomatis est une bactérie à développement intracellulaire obligatoire, divisée en 19 sérovars parmi lesquels les sérovars D-K sont responsables d’infections oculo-génitales et les sérovars L de la lymphogranulomatose vénérienne (LGV). En France, C. trachomatis est le principal agent bactérien responsable d’infections sexuellement transmissibles (IST). Les méthodes moléculaires occupent une place de choix dans le dépistage et l’épidémiologie des infections à C. trachomatis. Grâce à leur utilisation à partir de prélèvements non invasifs, nous disposons de chiffres de prévalence qui s’élèvent à 1,5% dans la population générale, 3,6% chez les femmes âgées de 18 à 24 ans sexuellement actives et 10 à 15% dans les centres à vocation de dépistage des IST. N’ayant aucune donnée chez la femme enceinte, le programme hospitalier de recherche clinique (MATIST) que nous avons mis en place chez les femmes enceintes suivies au CHU de Bordeaux a montré une prévalence de l’infection à C. trachomatis de 2,5%, à M. genitalium de 0,8% et à N. gonorrhoeae de 0%. Chez les femmes de moins de 24 ans, la prévalence était respectivement de 7,9% et 2,4%. La compréhension de l’épidémiologie et de la dissémination des infections à C. trachomatis nécessite la mise au point de techniques de typage performantes d’autant qu’un seul sérovar, le sérovar E, est rencontré dans près de la moitié des cas. Nous avons développé une méthode de typage moléculaire, la MLVA (MultiLocus Variable Number of Tandem Repeat Analysis), qui analyse le polymorphisme associé aux répétitions en tandem et permet un typage intra-sérovar. Cinq VNTRs ont été identifiés. La méthode a été automatisée puis appliquée à 220 souches et échantillons cliniques de C. trachomatis de génovar E, permettant d’identifier 25 types MLVA. Les souches d’origine ano-rectale isolées de patients homosexuels et les souches suédoises appartenant au nouveau variant ont été individualisées au sein de deux types MLVA uniques et distincts, suggérant une origine clonale. L’ensemble des résultats obtenus ont montré que la MLVA est un outil de typage moléculaire performant, plus discriminant que les autres méthodes auxquelles nous l’avons comparée. De plus, dans le cadre de la surveillance épidémiologique de la LGV ano-rectale due au variant L2b qui sévit en Europe depuis 2003 presque exclusivement chez les homosexuels, nous avons identifié le premier cas de LGV ano-rectale chez une femme. Enfin, nous avons développé une technique de PCR en temps réel permettant une détermination objective de la concentration minimale inhibitrice d’un antibiotique donné vis-vis de C. trachomatis. Cette technique a également montré que les antibiotiques étudiés n’avaient qu’une activité bactériostatique sur C. trachomatis.Chlamydia trachomatis is an obligate intracellular bacterium, divided into 19 serovars, among which serovars D-K are responsible for oculo-genital infections and serovars L of lymphogranuloma venereum (LGV). In France, C. trachomatis is the main bacterial cause of sexually transmitted diseases (STI). Molecular methods are the methods of choice for the C. trachomatis detection and epidemiology. Through their use, it has been shown that the prevalence of C. trachomatis infection rise up to 1.5% in the general population, to 3.6% for sexually experienced women aged 18-24 and to 10-15% in STI medical settings. As no data were available for pregnant women, we conducted a clinical research study (MATIST) in pregnant women at the Bordeaux University hospital. The prevalence of C. trachomatis, M. genitalium and N. gonorrhoeae infections was 2.5%, 0.8% and 0%, respectively. In women under 24 years, the prevalence of C. trachomatis, and M. genitalium infections was 7.9% and 2.4%, respectively. Understanding the epidemiology and the spread of C. trachomatis infection requires the development of efficient typing techniques knowing that a single serovar, serovar E, is found in nearly half the cases. We developed a MLVA (MultiLocus Variable-Number of Tandem Repeat Analysis) method which analyzes the genome polymorphism associated to tandem repeats and allowed intra-serovar subtyping. Five VNTRs were identified. The automated method was applied on 220 C. trachomatis genovar E clinical specimens and isolates, yielding 25 MLVA types. All anorectal isolates from men who have sex with men exhibited the same MLVA type, suggesting clonal spread. In the same way, we confirmed the clonal origin of the Swedish new variant of C. trachomatis. MLVA appears to be a good tool for molecular typing, with a higher discriminatory power than those of other methods used for comparison. Since 2003, a LGV proctitis outbreak caused by the new variant L2b has been reported in Europe in men who have had sex with HIV-positive men. We reported the first case of C. trachomatis L2b proctitis diagnosed in a woman. Finally, we developed a real-time PCR method allowing an objective determination of minimum inhibitory concentration of antibiotics for C. trachomatis. Our results also showed that all antibiotics studied only had bacteriostatic activity on C. trachomatis