Contribution to the understanding of the alpha-(1→2) branching mechanism of dextrans and gluco-oligosaccharides by GBD-CD2 enzyme : kinetic and structural studies

Issue de la troncature de la dextrane-saccharase DSR-E, l’alpha-(1→2) transglucosidase recombinante GBD-CD2 catalyse à partir de saccharose le branchement de molécules acceptrices tels que les dextranes, les isomalto-oligosaccharides ou les gluco-oligosaccharides (GOS ; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, avec 1<n<9). L’objet de cette étude a porté sur la compréhension des relations structure-activité de GBD-CD2 afin d’investiguer les facteurs structuraux responsables de la synthèse des liaisons osidiques de type alpha-(1→2). La troncature rationnelle du domaine de liaison au glucane (GBD) de l’enzyme GBD-CD2 (192 kDa) a abouti à l’isolement de trois formes tronquées actives, de masses moléculaires égales à 180, 147 et 123 kDa. Après purification de GBD-CD2 et de delta N123-GBD-CD2 (123 kDa), des études cinétiques ont permis de mettre en évidence que les enzymes présentent la même régiospécificité. L’activité d’hydrolyse du saccharose peut être modélisée par le modèle de Michaelis – Menten (kcat respectifs de 109 et 76 s-1). En présence de dextrane accepteur, ces enzymes sont activées. L’activité d’alpha-(1→2) glucosylation suit un modèle Ping Pong Bi Bi (kcat respectifs de 970 et 947 s-1). En modulant le ratio molaire entre le donneur d’unités glucosyle et l’accepteur de ces unités ([saccharose]/[dextrane]), il est possible de synthétiser des dextranes dont le pourcentage de liaisons alpha-(1→2) est contrôlé et varie de 10% à 40%. La caractérisation des produits de la réaction menée en présence de saccharose et de GOS a permis d’isoler et de caractériser pour la première fois des GOS arborant des unités glucosyle branchées en alpha-(1→2) sur les unités glucosyle adjacentes de la chaîne principale. Enfin, la résolution de la structure de delta N123-GBD-CD2 à 3,2 Å révèle que cette enzyme adopte le repliement original « en U » similaire à celui décrit pour GTF180-delta N. La comparaison des gorges catalytiques des deux dextrane-saccharases cristallisées apporte des éléments pouvant expliquer la régiospécificité singulière de delta N123-GBD-CD2, et ouvre la voie à des travaux de mutagenèse visant à investiguer le rôle de résidus potentiellement clésGBD-CD2 is a recombinant alpha-(1→2) transglucosidase constructed by truncation of the DSR-E dextransucrase from Leuconostoc mesenteroides NRRL B-1299. From sucrose, GBD-CD2 catalyses the alpha-(1→2) branching reaction onto acceptor molecules such as dextrans, isomalto-oligosaccharides or gluco-oligosaccharides (GOS; [6)-alpha-D-Glcp-(1→]n-alpha-D-Glcp-(1→4)-D-Glcp, 1<n