Characterization and functional studies of a plant class II glycine-rich protein LsGRP1 in plant defense

水楊酸與百合灰黴病菌誘導性百合防禦相關基因LsGRP1推定解碼一植物第二型富含甘胺酸蛋白。在本研究中，西方墨點檢測與串聯式質譜分析的結果顯示百合應具有14、16與23 kDa之葉部專一性表現的LsGRP1變體，其中14與16 kDa LsGRP1於不同生長時期之表現量均十分相近，但23 kDa LsGRP1的含量卻於老化時期急速衰減。透過免疫組織化學法、強化型綠色螢光蛋白成像與蛋白質萃取分析發現LsGRP1多累積於葉組織之表皮細胞與韌皮部，且14 kDa LsGRP1位於細胞膜而16與23 kDa LsGRP1弱鍵結於細胞壁。此外，水楊酸與百合灰黴病菌所誘導14 kDa LsGRP1與可被泛素抗體所辨識的23 kDa LsGRP1之累積，暗示23 kDa LsGRP1源自14 kDa LsGRP1之單泛素化並與百合誘導性抗病的發生有關，此特性未曾在其他植物第二型富含甘胺酸蛋白被報導。另一方面，大腸桿菌系統無法表現LsGRP1暗示其組成區段可能具有抗菌活性。使用化學合成的LsGRP1蛋白衍生性胜肽探討其抗菌特性，驗證對應富含半胱胺酸之C端片段的LsGRP1C為一兼具有效抗菌活性與廣泛抑菌圖譜之抗菌胜肽。進一步以SYTOX Green、H2DCFDA與DAPI染色探討LsGRP1C之作用機制，發現LsGRP1C經由影響細胞膜完整性與誘發真菌之類細胞程序性死亡以抑制真菌生長。甚者，LsGRP1C的免疫螢光定位聚集於真菌細胞表面，暗示位於植物細胞表面之LsGRP1能夠透過其C端區段之抗菌活性阻礙病原菌的入侵。綜合上述推斷，防禦相關蛋白LsGRP1在百合抵抗灰黴病菌的過程扮演重要角色，且其衍生性LsGRP1C為一具有實際應用潛力之抗菌胜肽。Salicylic acid- and Botrytis elliptica-inducible defense-related LsGRP1 gene in lily presumably encodes a plant class II glycine-rich protein (GRP). In this study, the results of western blot detection and tandem mass spectrometer analysis revealed that three LsGRP1 variants of 14, 16 and 23 kDa expressed in the leaves of lily specifically, and the expression of 14 and 16 kDa LsGRP1 remained a similar level at different growth stages while the amount of 23 kDa LsGRP1 decreased at the senescence stage. As investigated by immunohistochemistry, LsGRP1 was found to accumulate in the epidermal and the phloem tissues of leaves. The subcellular localization assayed by EGFP imaging and protein extraction analysis revealed that 14 kDa LsGRP1 was located in the plasma membrane whereas 16 and 23 kDa LsGRP1 were weakly bound to the cell wall. Additionally, the accumulation of 14 kDa LsGRP1 and ubiquitin antibody-recognizable 23 kDa LsGRP1 was triggered by salicylic acid and B. elliptica, suggesting that 23 kDa LsGRP1 comes from mono-ubiquitinated 14 kDa LsGRP1 and is related to the occurrence of induced resistance in lily. This is a novel trait never reported for other plant class II GRPs. On the other hand, the failure in LsGRP1 expression using Escherichia coli system suggested the presence of antimicrobial activity in certain region of LsGRP1, and LsGRP1C corresponding to the cysteine-rich C-terminal region was considered an antimicrobial peptide according to its broad-spectrum and effective antimicrobial activity as assayed using chemically synthesized LsGRP1-derived peptides. Furthermore, the inhibition effect of LsGRP1C on fungal growth is possibly via alteration of the integrity of cell membrane and induction of programmed cell death-like phenomenon as revealed by SYTOX Green, H2DCFDA and DAPI staining assays. Moreover, immunofluorescence of LsGRP1C present at the outer layer of fungal cells was indicated and implied that plant cell surface-localized LsGRP1 might retard pathogen via the antimicrobial activity conferred by its C-terminal region. Thus, defense-related LsGRP1 playing an important role in the induced resistance of lily against B. elliptica was assumed; in addition, LsGRP1C derived from LsGRP1 is an antimicrobial peptide with a potential for practical use.口試委員審定書 I 誌謝 II 中文摘要 III 英文摘要 IV 前言 1 前人研究 5 壹、 百合 5 貳、 百合病害與灰黴病 6 參、 誘導性抗病 7 肆、 百合防禦相關基因LsGRP1 10 伍、 植物富含甘胺酸蛋白 11 陸、 植物抗菌胜肽 13 第一章、植物第二型富含甘胺酸蛋白LsGRP1之雙重次細胞定位特性探討 16 壹、 中文摘要 17 貳、 英文摘要 18 參、 前言 19 肆、 材料與方法 21 一、 植物栽培 21 二、 病原菌培養與接種原製備 21 三、 分析LsGRP1表現特性之百合處理與取樣 21 四、 蛋白質萃取、Tricine-SDS-PAGE與西方墨點分析 22 五、 免疫共沉澱法與高效液相層析電灑法串聯式質譜儀分析 23 六、 免疫組織化學 24 七、 增強型綠色螢光蛋白所標定之蛋白於洋蔥表皮細胞的次細胞定位分析 25 八、 蛋白次細胞定位預測、膜蛋白拓撲學(topology)分析與泛素化位點預測 26 九、 界面活性劑輔助蛋白萃取 26 十、 質外蛋白 (apoplastic proteins) 萃取 27 十一、 自分離細胞壁萃取弱鍵結細胞壁蛋白 (weakly bound-cell wall protein)…. 27 十二、 細胞壁分解酵素輔助蛋白萃取 28 伍、 結果 29 一、 LsGRP1蛋白的分布具有葉專一性 29 二、 以串聯式質譜分析確認LsGRP1蛋白變種 29 三、 LsGRP1主要累積於葉部表皮與維管束組織 30 四、 LsGRP1具有在細胞膜與細胞壁之雙重次細胞定位 30 五、 細胞膜蛋白14 kDa LsGRP1 31 六、 弱鍵結於細胞壁之16與23 kDa LsGRP 32 七、 水楊酸處理與灰黴病菌接種誘發LsGRP1泛素化 33 陸、 討論 34 柒、 圖表集 37 表一、以軟體ProtComp ver. 9.0預測LsGRP1次細胞定位 38 圖一、LsGRP1表現之時間與空間特性分析 39 圖二、以高效液相層析電灑法串聯式質譜分析鑑定LsGRP1 40 圖三、LsGRP1於葵百合葉部之免疫組織分布 42 圖四、以強化型綠色螢光蛋白成像法觀察LsGRP1次細胞定位 43 圖五、細胞膜蛋白14 kDa LsGRP1 44 圖六、弱鍵結於細胞壁的16與23 kDa LsGRP1 45 圖七、LsGRP1的誘導累積與泛素化….. 47 第二章、百合LsGRP1蛋白之衍生性抗菌胜肽LsGRP1C 48 壹、 中文摘要 49 貳、 英文摘要 50 參、 前言 51 肆、 材料與方法 53 一、 試驗微生物 53 二、 抗菌胜肽預測 54 三、 胜肽製備 54 四、 抑菌試驗 54 五、 SYTOX Green染色 55 六、 H2DCFDA染色 55 七、 DAPI染色 56 八、 免疫螢光定位法 56 伍、 結果 58 一、 抗菌活性預測 58 二、 LsGRP1衍生性胜肽之抗細菌活性分析 58 三、 LsGRP1衍生性胜肽之抗真菌活性分析 58 四、 LsGRP1C有效抑制細菌與真菌的生長 59 五、 LsGRP1C破壞真菌細胞膜完整性與誘發類程序性細胞死亡現象……… 59 六、 LsGRP1C位於受處理真菌細胞表面 60 陸、 討論 61 柒、 圖表集 64 表一、LsGRP1C對不同細菌與真菌的半致死濃度 65 圖一、LsGRP1衍生性胜肽示意圖與抑菌活性預測 66 圖二、LsGRP1衍生性胜肽之抗菌活性分析 67 圖三、LsGRP1C對植物病原真菌所造成之影響 69 圖四、於植物病原真菌之菌絲進行LsGRP1C免疫螢光染色 70 總 結 71 參考文獻 73 附錄 85 壹、 Characterization of the dual subcellular localization of Lilium LsGRP1, a plant class II glycine-rich protein 86 貳、 A potent antimicrobial peptide derived from the protein LsGRP1 of Lilium 10