Functional characterization of IbWIPK and IbMEK1 involved in biotic stress tolerance in sweet potato

SPORAMIN為甘藷中所特有的抗蟲基因，截至目前已發現IbNAC1轉錄因子可直接與SPORAMIN啟動子上的受傷反應元件專一結合，並在受傷訊息傳遞中，正向調控下游SPORAMIN基因表現，此訊息傳遞需要透過MAPK來放大受傷訊息以活化IbNAC1表現。本研究從甘藷cDNA基因庫中選殖出一個可經受傷、茉莉酸與過氧化氫誘導表現的MAPK基因，並命名為IbWIPK。以阿拉伯芥原生質體進行轉錄活性測試，發現相對於單獨表現proIbNAC1::GUS植株，共表現35S::IbWIPK與proIbNAC1::GUS之轉殖株具有較高的GUS 活性，由此得知，IbWIPK具有活化下游IbNAC1基因表現的能力。大量表現IbWIPK之阿拉伯芥轉殖株，相較於空載體轉殖之對照組植物，其對鹽逆境較敏感，並且具有茉莉酸、乙烯及生長素累積過多之植物形態特徵。茉莉酸、乙烯與生長素相關的指標性基因，在大量表現IbWIPK的阿拉伯芥具有較高的表現，因此可推測這些形態是由於過度累積茉莉酸、乙烯與生長素所造成。大量表現IbWIPK的阿拉伯芥轉殖株可藉由增加VSP2、CYSTEINE PROTEINASE與TERPENE SYNTHASE的表現量，來提高轉植株對斜紋夜盜蛾幼蟲的抗性。在大量表現IbWIPK甘藷轉殖株中，SPORAMIN活性也到大幅度的提升。此外，本研究中也釣取IbWIPK上游交互作用之蛋白分子IbMEK1(MAPKK)，並進行功能性分析。綜合這些結果，在甘藷抗蟲的機制上，IbWIPK可協同調控茉莉酸與乙烯的抗蟲訊息路徑，進而促使植物達到自我保護的防禦效果。A NAC-domain transcription factor, IbNAC1, is known to positively regulate SPORAMIN expression, which has been identified as an unique insect-resistant gene in sweet potato, via binding to the wound-responsive cis-element of SPORAMIN promoter. This wound signal transduction requires MAPK cascades to amplify the signal to activate IbNAC1. In this study, we identified a wound-, MeJA- and H2O2-inducible MAPK gene named IbWIPK. Co-transformation of 35S::IbWIPK effector and proIbNAC1::GUS reporter in plant showed the increased GUS activity compared to reporter alone, suggesting that IbWIPK plays a positive and directive role on IbNAC1 activation. Notably, the Arabidposis plants overexpressing IbWIPK (IbWIPK-OE) exhibited sensitive to salt stress and showed JA/ET-response phenotype. The indicator genes of JA, ET and auxin were elevated in IbWIPK-OE plants, implying that those phenotypes were formed by accumulation of JA and auxin. These plants were increasingly resistant to Spodoptera litura due to high expression of VSP2, CYSTEINE PROTEINASE and TERPENE SYNTHASE. In transgenic sweet potato, the activity of SPORAMIN was enhanced by the overexpression of IbWIPK. Moreover, IbMEK1 (MAPKK), which was physically interacted with IbWIPK, was also identified and characterized in this study. Collectively, these results suggest that IbWIPK plays a critical role in coordinating herbivore signal in JA/ET pathway against herbivory in plants.目錄 口試委員審定書………………………………………………………………………i 致謝……………………………………………………………………………………ii 中文摘要……………………………………………………………………………...iii Abstract…………………………………………………………………………….…iv 檢索表…………………………………………………………………………...……iii 目錄………………………………………………………………………………..vii 圖表目錄…………………………………………………………………………........x 附圖表目錄……………………………...…………………………………………...xii 第一章 前言 第一節 植物防禦機制…………………………………………………………..1 第二節 植物受傷訊息傳遞路徑………………………………………………..2 第三節 甘藷中的SPORAMIN……………………………………………..7 第四節 NAC轉錄因子…………………………………………………………9 第五節 SPRAMIN 與IbNAC1之上游受傷訊息傳遞路徑…………….…....10 第六節 有絲分裂原蛋白激酶路徑 mitogen-activated protein kinase pathway, MAPK pathway…………………………………………………….….11 第七節 植物MAPKs對生物性逆境防禦之調控…………………………….16 第八節 研究目的………………………………………………………………18 第二章 材料與方法 第一節 基因表現量測定………………………………………………………20 第二節 全長基因序列選殖……………………………………………………25 第三節 基因之啟動子調取…………………………………………………....31 第四節 載體構築………………………………………………………….…...35 第五節 阿拉伯芥基因轉殖與分析……………………………………………41 第六節 甘藷基因轉殖與分析…………………………………………………43 第七節 阿拉伯芥原生質體轉型………………………………………………48 第八節 西方墨點轉印法………………………………………………...…….50 第九節 β葡萄糖甘胺酸(GUS)活性之測定………………………………….53 第十節 酵母菌轉型……………………………………………………………56 第十一節 植株之處理方法……………………………………………………58 第三章 結果 第一部份 甘藷內生性受傷誘導型MAPK基因選殖與功能性分析 第一節 IbWIPK基因選殖與親緣關係樹分析………………………….….....62 第二節 甘藷內生性IbWIPK受傷反應分析及其在各個器官表現情形…….62 第三節 植物賀爾蒙、過氧化氫與非生物逆境對於內生WIPK基因之調控情形…..…………………………………………………………………..63 第四節 IbWIPK在受傷反應下的激酶活性分析……………………..…...….64 第五節 IbWIPK細胞定位分析…………………………………..……..….….65 第六節 IbWIPK對於IbNAC1啟動子的活化能力檢測………….……..….…66 第七節 IbWIPK對調控植物生長型態之關聯性……………………………..67 第八節 IbWIPK-OE阿拉伯芥之逆境抗性分析…………………………..….70 第九節 甘藷之轉基因植株鑑定與SPORAMIN活性分析…………………..72 第十節 IbWIPK受傷誘導之啟動子分析…………………………………..…73 第二部分 IbWIPK上游交互作用之MAPKK-IbMEK1功能性分析 第一節 IbMEK1基因釣取與親緣關係樹分析………….…………………….77 第二節 IbWIPK與IbMEK1交互作用之探討…………...………………...….77 第三節 IbMEK1細胞定位分析………………………….…………………....78 第四節 甘藷內生性MEK1空間分布表現情形與受傷誘導分析..…….…….79 第五節 植物賀爾蒙與鹽逆境對於內生MEK1基因的調控情……….…..….79 第六節 IbMEK1對proIbNAC1之轉錄活性檢測……………………......……80 第七節 IbMEK1之功能性分析…………………………………….………….81 第八節 甘藷之轉基因植株建立與生物逆境分析……………………………81 第四章 討論 第一節 探討IbWIPK表現之機制……………………………….……….……83 第二節 IbWIPK之功能性分析研究……………………………….……..…...86 第三節 IbWIPK啟動子序列與調控機制…………………………..…..….….90 第四節 IbMEK1在甘藷中所扮演的角色………………………………....…..92 第五節 未來展望……………………………………………………………....95 參考文獻…………………………………………………………………………..…97 圖表…………………………………………………………………………….…...110 附圖表……………………………………………………………………………....151 圖表目錄 圖一 、IbWIPK與其他物種MAPK之親緣演化與胺基酸序列分析…….110 圖二、IbWIPK與菸草WIPK、SIPK、NTF4及阿拉伯芥MPK3、4、6胺基酸編碼序列比對…………………………………………………………………111 圖三、IbWIPK受傷誘導反應與空間分佈表現情形…………………………..112 圖四、IbWIPK可受茉莉酸、H2O2處理與高鹽逆境可誘導表現…………….....113 圖五、受傷處理後之甘藷激酶活性檢定…………………………………………114 圖六、IbWIPK融合螢光蛋白表現載體構築示意圖……………………………...115 圖七、IbWIPK胞內定位分析……………………………………………………...116 圖八、IbWIPK對於IbNAC1啟動子轉錄活性分析…………………………….117 圖九、35S::IbWIPK載體構築示意圖………………………………………….….118 圖十、阿拉伯芥大量表現IbWIPK轉殖株鑑定與基因表現量分析…………..….119 圖十一、IbWIPK-OE轉殖阿拉伯芥IbWIPK激酶活性分析……………………..120 圖十二、大量表現IbWIPK對阿拉伯芥根部發育型態之影響………………..….121 圖十三、過度表現IbWIPK對阿拉伯芥花期調控之影響………………………...122 圖十四、IbWIPK-OE轉殖阿拉伯芥植物外觀型態觀察…………………123 圖十五、IbWIPK-OE與EV轉殖阿拉伯芥葉片具有提早黃化之特徵……………124 圖十六、大量表現甘藷WIPK對於下游荷爾蒙指標性基因表現量之影響……..125 圖十七、大量表現IbWIPK轉殖阿拉伯芥可提高植株對斜紋夜盜蛾幼蟲之抗..126 圖十八、大量表現IbWIPK之阿拉伯芥會降低植株對鹽逆境之耐受性………..127 圖十九、大量表現IbWIPK可提植株體內H2O2之含量…………………………..128 圖二十、大量表現IbWIPK之轉基因甘藷具有較高活性的SPORAMIN…...129 圖二十一、IbWIPK啟動子cis-element序列預測圖………………………………130 圖二十二、proIbWIPK::GUS載體構築示意圖………………………………...…131 圖二十三、甘藷WIPK啟動子可受受傷、茉莉酸、H2O2與水楊酸誘導活化…132 圖二十四、阿拉伯芥proIbWIPK轉殖株組織差異性表現……………………….133 圖二十五、甘藷MEK1與其他物種之MAPKK親緣演化分析……………...……134 圖二十六、IbWIPK酵母菌雙雜合載體構築示意圖……………………….……135 圖二十七、IbMEK1酵母菌雙雜合載體構築示意圖……………………………..136 圖二十八、IbWIPK與IbMEK1存在交互作用之關係…………………………....137 圖二十九、IbMEK1融合螢光蛋白表現載體構築示意圖…………………….…138 圖三十、IbMEK1胞內定為分析……………………………………………….…..139 圖三十一、甘藷IbMEK1受傷誘導反應與空間分佈表現情形………………..…140 圖三十二、外加賀爾蒙與鹽逆境處理對甘藷MEK1表現情形的影響……...…141 圖三十三、甘藷MEK1對於IbMAC啟動子轉錄活性分析…………………….142 圖三十四 、35S::IbMEK1載體構築示意圖……………………………………..143 圖三十五、阿拉伯芥大量表現IbMEK1轉殖株鑑定與基因表現量分析………144 圖三十六、大量表現IbMEK1轉基因甘藷轉鑑定與植株型態分析……………145 圖三十七、大量表現IbMEK1可增加甘藷對斜紋夜盜蛾幼蟲之抗性…………146 圖三十八、IbWIPK調控甘藷抗蟲防禦機制之假說模型…………………….…147 表一、利用PlantCARE預測可能存在於IbWIPK啟動子上之cis-element……148 表二、對已發表之MAPK 進行NLS序列預測………………………………....149 附圖表目錄 附圖一、proIbNAC1::GUS轉殖甘藷與轉殖阿拉伯芥………………………..…151 附圖二、pERK1/2抗體專一性檢測……………………………………………....152 附圖三、甘藷轉殖流程圖…………………………………………………………153 附表一、本研究所使用之引子序列總整理…………………………...………….15