Mechanisms of Cytotoxicity by Five Conventional and Nano Dentin Bonding Agents to CHO-K1 cells

實驗目的: 本實驗是藉由中國倉鼠卵巢細胞的體外試驗，評估並比較市售的五種牙本質黏著劑對細胞毒性及基因毒性的影響，所選擇的廠品包括3種成分為奈米填料(B:Voco Futurabond NR, C: 3M Singlebond 2, D:Dentsply Prime & Bond NT)、2種成分為傳統的非奈米填料(A:Voco Solobond M, E:Dentsply Xeno III)。驗材料與方法: 中國倉鼠卵巢細胞在五種牙本質黏著劑以不同濃度(1/40000-1/20, v/v, %)及陰性對照組(0.5%的DSMSO)作用下暴露24小時。細胞毒性的評估是利用細胞群落形成效率分析(CFE)，並分別利用PI (40ug/ml)和DCFH-DA的染色下，利用流式細胞儀進行細胞週期及活性氧的評估。再利用Modfit軟體進行G0/G1期, S期, G2/M期和sub-G0/G1等細胞週期所佔比例的評估，並利用mean DCF fluorescence的值評估活性氧產生的程度。此外，並結合細胞質分裂阻斷之微核分析 (CBMN)輔以DAPI染色的技術下，計算凋亡細胞、微核細胞、核質間橋等細胞的數量，進行基因毒性的檢測。驗結果: 五種不同的牙本質黏著劑對中國倉鼠卵巢細胞產生了不同程度的細胞毒性影響。計算TC50所獲得的細胞毒性排名依序是：(D)>>(E)≧(C)>(A)>(B)。在高濃度的條件下，五種牙本質黏著劑皆會誘導sub-G0/G1值的增加。利用Modfit軟體進行細胞週期的評估，則可以看到在24小時的給藥時間下，B.C.D組出現顯著的G2/M期細胞週期停滯；A.C.D組則出現G0/G1期停滯的現象。而利用mean DCF fluorescence偵測到的活性氧含量，A,C,D,E在濃度為1/40 (%)時與其他濃度出現顯著差異；B組則在1/40 (%)和1/20(%)較其他濃度出現統計上的顯著差異。基因毒性的測試結果，誘導凋亡細胞產生的比例與細胞存活率實驗獲得一致性的結果；較高的微核頻率則發生在含有較小奈米填料的組別 (B,C,D)；核質間橋的數量則伴隨微核細胞頻率的增加，也顯示增加的趨勢。核質間橋的出現一方面代表了染色體的修復，另一方面也顯示了基因受損的程度。 論: 五種不同的牙本質黏著劑分別產生了不同程度的細胞毒性影響，這可能與牙本質黏著劑內含的各種成分有關。細胞毒性可能來自於成分中活性氧的產生，而誘導細胞凋亡和細胞週期的停滯所致。由我們的實驗結果得知，奈米填料的存在與否將不是決定毒性大小的唯一因素，但是奈米填料的出現，卻有可能提高染色體的損傷或遺失，導致細胞中微核及核質間橋的增加，而此結果我們推論奈米填料的出現可能引致進一步的基因毒性。這些結果與進一步的發現將對於臨床復型牙科在牙本質黏著劑的運用與瞭解上有實質性的幫助。Objectives: To compare the cytotoxicity & genotoxicity of five dentin bonding agents (DBAs), including three nano-DBAs (DBA-B:Voco Futurabond NR, DBA-C: 3M Singlebond 2, and DBA-D:Dentsply Prime & Bond NT) and two non-nano-DBAs (DBA-A:Voco Solobond M and DBA-E:Dentsply Xeno III) by using Chinese hamster ovary (CHO-K1) cells.ethods: CHO-K1 cells were exposed to different concentrations of DBAs (1/40000-1/20, v/v, %) and negative control(DMSO) for 24 hrs. Cytotoxicity of DBAs was evaluated by colony formation efficiency. For cell cycle analysis and reactive oxygen species (ROS) production, CHO-K1 cells were treated with DBAs and then stained with propidium iodide (40ug/ml) or dichlorofluorescein–diacetate (DCFH-DA), respectively, and finally subjected for flow cytometric analysis. The percentage of cells in G0/G1, S, G2/M and sub-G0/G1 phases were determined. The mean DCF fluorescence was used to evaluate cellular ROS levels. Additionally, genotoxicity of DBAs was evaluated by CBMN & DAPI staining.esults: DBAs showed differential cytotoxicity to CHO-K1 cells. The potency of cytotoxicity was (D)>>(E)≧(C)>(A)>(B). All five DBAs induced sub-G0/G1 cell population at higher concentrations. After exposure of CHO-K1 cells to B.C.D for 24 h, marked G2/M cell cycle arrest was noted, whereas A.C.D induced G0/G1 cell cycle arrest. DBAs also induced ROS production as indicated by an increase in mean DCF fluorescence after exposure to DBAs (A,C,D,E at a concentration of 1/40 (%), and B at a concentration of 1/40(%) or higher,1/20(%)). About genotoxicity, significant increase of MN frequency & NPB was noted in DBAs(B,C,D), including composition of nano-filler. onclusions: These five DBAs showed differential cytotoxicity to CHO-K1 cells. Cytotoxicity can be due to induction of apoptosis and arresting of cell cycles by components in DBAs and associated with ROS production. Absence or presence of nano-fillers is not the major cytotoxic factor for these DBAs, but significant increase of MNs & NPB could represent DNA loss or damage from nano-filler of DBAs. These results are useful for clinical operative restorative procedures.謝誌 i文摘要 iii文摘要 v錄 vii次 x錄 xi一章 文獻綜論 1.1 牙科奈米科技的發展及牙本質黏著劑在臨床上的應用 1.1.1 牙本質黏著劑的歷史發展暨系統的演變 1.1.2 牙本質黏著劑在臨床上的運用 5.1.3 牙科奈米科技的發展 6.2 不同黏著劑單體對細胞的影響 7.3 牙本質黏著劑（單體）對細胞週期與細胞凋亡的影響 8.3.1 活性氧物種（reactive oxygen species, ROS）對細胞的影響 9.3.2 細胞的凋亡（Apoptosis） 10.3.3 細胞週期的調控分子－p53 11.4 染色體變異試驗(in vitro chromosome aberration test) 11.5 基因毒性與微細胞核(Micronucle)的產生 12.6 細胞質分裂阻斷之微核分析技術(Cytokinesis-block micronucleus assay)..13.7 細胞模式實驗 14驗動機與目的 15二章 實驗材料與方法 16.1 實驗材料與藥品來源 16.2 牙本質黏著劑的濃度(v/v ％)與分裝 18.3 細胞株與細胞培養 19.4 細胞存活率試驗 20.5 基因毒性與免疫螢光顯微鏡 (Immunofluorescence microscopy)的運用 20.5.1 利用DAPI染色標記細胞核的位置 20.5.2 CBMN methodology under DAPI stain 21.6 利用流式細胞技術分析細胞內活性氧(ROS)含量 22.7 利用流式細胞儀分析細胞週期之變化 23.8 統計分析 24三章 實驗結果 25.1 牙本質黏著劑在高濃度下會抑制CHO-K1 細胞的生長與造成細胞毒性 25.1.1 長期細胞存活率分析 ~ 細胞群落形成效率分析 25.1.2 長期細胞存活率分析 ~ TD50的計算 25.2 牙本質黏著劑在高濃度的條件下會改變CHO-K1細胞之細胞形態 26.3 牙本質黏着劑會造成細胞內活性氧含量的上昇 26.4 牙本質黏着劑對細胞週期的影響 27.5 牙本質黏著劑誘導的基因毒性對細胞死亡的影響 28.5.1 Apoptosis/necrosis 的實驗結果 30.5.2 微核的實驗結果分析 30.5.3 核質小橋的實驗結果分析 31四章 討論 33.1 不同牙本質黏着劑對細胞毒性所造成的影響 33.2 牙本質黏着劑引起活性氧的增加及抑制劑的使用 34.3 牙本質黏着劑造成細胞週期停滯的討論 35.4 不同牙本質黏着劑對基因毒性所造成的影響 36.5 單體差異與牙本質黏着劑毒性的的影響 37.6 牙本質黏着劑其餘組成及光聚合程度對毒性造成的影響 39五章 總結 41考文獻 42 次1、牙本質黏著劑滲入牙本質小管的電子顯微鏡圖片 532、特殊實驗材料化學結構式 543、DMSO所產生的細胞毒性影響 554、Bis-GMA的結構式 565、細胞存活率實驗統計圖 576、細胞存活率實驗照片 587、五種牙本質黏著劑TC50的比較 598、不同濃度牙本質黏著劑作用下細胞形態的改變 609、活性氧含量的比較 6110、樣本(A)／ PI染色 & 細胞週期的分析 6211、樣本(B)／ PI染色 & 細胞週期的分析 6312、樣本(C)／ PI染色 & 細胞週期的分析 6413、樣本(D)／ PI染色 & 細胞週期的分析 6514、樣本(E)／ PI染色 & 細胞週期的分析 6615、Apoptosis (DAPI染色下的記數結果) 6716、微核 (DAPI染色下的記數結果) 6817、核質間橋 (DAPI染色下的記數結果) 6918、利用ICP-MS 分析偵測內含的金屬成分 70 錄錄1、染色體受損時的修復機制 71錄2、DNA障礙下，錯誤修復產生NPB & MN 的方式 72錄3、真核細胞有絲分裂的分期 73錄4、細胞週期 74錄5、染色體染色判讀 75錄6、DAPI染色 (MN & NPB) 7