The investigation of structural conversion of Mogrosides, a group of triterpene-glycosides from Siraitia grosvenorii, in acid and yeast model systems using HPLC-ESI-tandem mass spectrometry

羅漢果皂素為一群具有甜味與生理功能性的三萜類醣苷分子，為暸解食品加工中此類醣苷分子的轉換結構，本論文以液相層析串聯電灑式多次質譜方法，探討羅漢果皂素在酸與酵母菌模擬模式中結構轉換。使用市售羅漢果果實濃縮萃取物為原料，其中含有帶有五個葡萄醣基之 mogroside V 含量為25.56%，為主要的皂素結構。使用逆相的碳十八固相萃取管，以45-80%甲醇可以自羅漢果水萃物中分離得到此類皂素；使用碳十八逆相層析分析管柱，以45-75%甲醇梯度可以分離含有不同數目醣基結構的羅漢果皂素。在酸性溶液系統的轉化實驗中，使用濃度2N的鹽酸溶液，以溫度60℃加熱三小時，可以由mogroside V酸水解得到十一種帶有不同醣基之羅漢果皂素，以串聯式電噴灑游離(electrospray ionization, ESI)質譜的正離子模式，可由特殊斷裂片段訊號，初步判斷其醣苷鍵結模式，再由核磁共振HSQC圖譜比對，確認帶有四個葡萄醣基的羅漢果皂素質譜特徵和核磁共振結構相符；以負離子模式觀察，可以鑑定依序減少葡萄醣基的質譜特徵。在酵母菌反應的實驗中，將羅漢果萃取物與酵母菌Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild type在YPD培養液中反應零至六小時，發現經過四小時後，mogroside V含量明顯下降，而siamenoside I (四個醣基)、mogroside IV (四個醣基)與mogroside III(三個醣基)含量有明顯的上升，顯示酵母菌可選擇水解利用羅漢果皂素的beta-1,6-醣苷鍵結，使siamenoside I、mogroside IV、mogroside III含量上升。依照文獻前述三種水解產物仍具有強於蔗糖195-465倍的甜味，表示以羅漢果萃取物作為酵母菌相關食品的甜味劑，經過酵母菌發酵後仍可保持甜味性質。Mogrosides are major triterpenoidal saponins in fruits of Siraitia grosvenorii, Lo Han Kuo, with intensive sweetness and many biological activities. To establish an analytical protocol of mogrosides for food quality control, a liquid chromatography- electron spray ionization- tandem mass spectrometric method, LC-ESI-MS/MS, was developed to investigate the structural conversion of the mogrosides in acid and yeast model systems. A commercial extracted and concentrated product was used as studying material. The major component of the mogrosides was found to be the penta-glucosyl saponin, mogrosides V, in the commercial product. Its content was as high as 25.56% of the weight of the product studied. All types of mogrosides could be enriched by using reversed phase C-18 solid-phase-extraction cartridges in the fraction eluted out with 45-80% of methanol and separated by a reversed phase C-18 analytical HPLC column in a water/methanol gradient elution with 45-75% methanol ratio (V/V). Eleven different mogrosides differing in glucosly numbers and glycosidic linkages could be obtained from acid hydrolysis model system using 2N hydrocholoric acid solution with heating in 60°C for 3 hours and be distinguished through their molecular weight and specific fragment patterns in the positive ion mode of electrospray-ionization by a linear ion-trap mass spectrometric analysis, respectively. These glucopyranosyl units could be lost sequentially in the negative collision-induced dissociation (CID) mode on mass spectrometric analysis. In the yeast model system, Saccharomyces cerevisiae BY4741 wild type converted majority of mogrosides V into siamenoside I (with 4 glucosyl moieties), mogroside IV (with 4 glucosyl moieties) and mogroside III (with 3 glucosyl moieties) without substantial amount of mogrosides with one or two glucosyl moieties and aglycone. The structures of mentioned three mogrosides were further confirmed by nuclear magnetic resonance (nmr) analysis.he results indicated that the enzyme system of the yeast used could selectively hydrolyze the (1, 6)-beta-glycosidic linkage of mogrosides but not (1, 2)-beta-glycosidic linkage on the mogrosides. According the literature, the remaining mogrosides, siamenoside I, mogroside IV and mogroside III, still presents 195 ~ 465 times sweetness higher than sucrose. These results imply that the mogrosides can be used as a sweetener in the yeast fermented food system.中文摘要I文摘要II目錄IV目錄VIII目錄XI、前言 1、文獻整理 2、皂素 Saponins 2一) 化學結構 2二) 來源 5三) 生理活性 5、羅漢果皂素Mogrosides 6一) 結構 6二) 含量 10三) 感官特性 12四) 生理功能 13、羅漢果皂素的分析方法 19一) 純化方式 19二) 高效能液相層析法 21三) 以核磁共振進行結構鑑定 25四) 質譜儀分析 26、羅漢果Siraitia grosvenorii 33一) 外型、產地與分佈 33二) 化學成分組成 34三) 生理功能 35四) 加工產品 35、甜味劑 Sweeteners 36一) 定義與分類 36二) 使用目的 37、高強度甜味劑-甜菊皂素的加工穩定性 39、醣苷化合物在烘焙加工中之變化-以黃豆異黃酮醣苷為例 40一) 異黃酮(isoflavone)化學結構 40二) 黃豆麵包 41三) Beta-glucosidase酵素對異黃酮種類與含量的影響 42四) 黃豆麵包後發酵時間對異黃酮種類與含量的影響 43五) 黃豆麵包烘烤前後對異黃酮種類與含量的影響 44amp;#21441;、研究目的 45、實驗流程 46、羅漢果皂素的純化與鑑定 46、羅漢果皂素的結構轉換 47一) 化學性酸水解對羅漢果皂素的反應 47二) 生物性酵母菌對羅漢果皂素的反應 48、材料與方法 49、材料與方法 49、實驗材料 49、實驗藥品 49一) 標準品 49二) 試藥 49三) 酵母菌培養材料 50、儀器設備 50一) 層析耗材 50二) 一般儀器設備 50三) 高效能液相層析系統 51四) 高效能液相層析與質譜串聯系統 52五) 核磁共振儀與光譜產理軟體 52、實驗方法 52一) 羅漢果萃取物溶液製備 52二) 以固相萃取分離羅漢果皂素 52三) 羅漢果皂素 mogroside V酸水解 53四) 羅漢果皂素的高效能液相層析 53五) 羅漢果皂素的質譜分析 54六) 羅漢果皂素的液相層析串聯質譜分析 56七) 酵母菌S. cerevisiae BY4741 wild type菌株的培養與保存 58八) 不同濃度的羅漢果萃取物，對酵母菌生長的影響 58九) 酵母菌對羅漢果皂素的轉換 59十) 羅漢果皂素的核磁共振分析 59、結果與討論 62、羅漢果皂素的純化與鑑定 62一) 固相萃取管純化羅漢果皂素 62二) Mogroside V標準品和純化自羅漢果萃取物之HSQC圖譜 63三) 高效能液相層析圖譜檢量線 66四) 以相萃取管淨化mogroside V之回收率 67五) 加入酸鹼改性劑(modifier)對羅漢果皂素游離化影響 67六) 液相層析串聯質譜游離參數最佳化 73七) 液相層析串聯質譜mogroside V檢量線 73八) 添加(spike)實驗 78、化學性酸水解對羅漢果皂素的結構變化 78一) 不同反應條件之結構變化 78二) 以負離子模式直接注入串聯質譜(infusion)分析 83三) 液相層析串聯質譜負離子模式分析 86四) 以正離子模式直接注入串聯質譜(infusion)分析 87. 帶有四個葡萄醣基的羅漢果皂素 87. 帶有三個葡萄醣基的羅漢果皂素 94. 帶有二個葡萄醣基的羅漢果皂素 96、生物性酵母菌對羅漢果皂素的結構轉變 98一) 不同濃度羅漢果萃取物對酵母菌的生長影響 98二) 高效能液相層析分析 99三) 液相層析串聯質譜分析 100四) 直接注入串聯質譜(infusion)分析 103五) 經酵母菌反應產生的產物4羅漢果皂素之HSQC圖譜 107、結論 110、參考文獻 112、附錄 12