Isolation and identification of antitumor and anti-inflammatory active components from adlay bran

薏苡為禾本科一年生草本植物，長期以來是被用於對抗腫瘤及發炎的傳統中藥，目前研究也陸續闡明薏苡的生理功效，且已證實含麩皮的糙薏仁比精白薏仁有較高的抗癌及抗發炎活性。綜合文獻結果推測，薏苡籽實中，特別是薏仁麩皮中一定含有某些抑癌、抗發炎活性成分，然而針對薏仁麩皮的抗癌、抗發炎活性成分尚未完全明瞭，故本研究基於探討食品抑癌、抗發炎作用之目的，將以活性區分為導向分離純化出薏仁麩皮中具有生理功效之成分。究結果發現薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層（ABM-EtOAc）對肺癌及腸癌細胞之生存力具有最顯著抑制的效果，並發現其可誘導癌細胞發生細胞週期改變和細胞凋亡。在抗發炎之研究發現，ABM-EtOAc及薏仁麩皮甲醇萃取物正丁醇區分層（ABM-BuOH）可抑制LPS所誘發之老鼠巨噬細胞RAW 264.7釋放促發炎細胞激素TNF-α及IL-1β，並且在50 μg/mL濃度之下之ABM-EtOAc及ABM-BuOH皆具有抑制人類肺癌細胞A549及人類腸癌細胞HT-29之COX-2蛋白表現的效果，而對常在型COX-1酵素並無顯著影響，其中尤以ABM-BuOH活性最佳。此結果顯示ABM-EtOAc及ABM-BuOH中一定含有一些抑癌、抗發炎活性成分，藉由促進癌細胞凋亡來達到抑制癌細胞生長，並且這些植物化學成分具有預防慢性發炎導致之癌病變功效。一步自ABM-EtOAc中以抑制肺癌及腸癌細胞生長為導向，純化鑑定出25個純化合物。純化合物中Coixspirolactam A、Coixspirolactam B、Coixspirolactam C鑑定為新化合物；5-Hydroxy-7-methoxy-4''-acetylisoflavone、Coixlactame、Coixspirolactone為天然物中首次分離之化合物；Caffeic acid、Protocatechuic acid、Chlorogenic acid、3-O-Coumaroyl-5β-sitostanol、3-O-Caffeoyl-5β-sitostanol、Methyl dioxindole-3-acetate及三萜類24,25-Oxidocycloartanol為首次由薏仁中分離出來之化合物。所分離出之純化合物之抑癌活性檢測結果顯示，異黃酮類5-Hydroxy-7-methoxy-4''-acetylisoflavone、三萜類24,25-Oxidocycloartanol、酚酸酯類3-O-Coumaroyl-5β-sitostanol、3-O-Feruloyl-5β-sitostanol、3-O-Caffeoyl-5β-sitostanol具有抑制此A549、HT-29、COLO 205癌細胞生長之作用，而酚酸類中只有Caffeic acid、Protocatechuic acid、Chlorogenic acid具有抑制三株癌細胞生長之效果。一方面，以抗發炎為活性導向，自ABM-BuOH中利用多種分離技術純化出9個與ABM-EtOAc不重複的純化合物，包括：1個Apocarotene：Loliolide、1個三萜類：3β-Hydroxyolean-18-en-28-oic acid、1個木酚素：Pinoresinol、1個酚酸酯類：(E)- methyl 3,4-dihydroxycinnamate、1個接有糖基的固醇類：β-Sitosteryl-3β-glucopyranoside、1個異黃酮：Biochanin A、3個類黃酮類化合物：5, 7-Dimethoxy-4''-hydroxyflavan、4'', 5, 7-Trihydroxyflavone、Farrerol，此9個純化合物皆為薏苡中首次分離出來之化合物。Adlay (Coix lachryma-jobi L. var. ma-yuen Stapf ) is an one year grass crop that has long been used as a traditional Chinese medicine to treat tumor and inflammation. Recent studies have continuously demonstrated the physiological effects of adlay and reveal that duhulled adlay posseses a higher anti-tumor and anti-inflammation activity than polished adlay. In summation of references, the adlay seeds contain some anti-tumor or anti-inflammation active compounds especially in the adlay bran. However, the active constituents involved in anti-tumor or anti-inflammation activity are still unknown. Therefore, the aim of our study is based on to discuss function of anti-tumor and anti-inflammation in food, to separate and identify the physiological effective constituents contained in adlay bran via active fractions.he study results show that the ethyl acetate fraction from adlay bran methanolic extract (ABM-EtOAc) had the highest ability to reduce survival rate of lung and colorectal carcinoma cell. It is also found that inhibition of cell cycle phase change, and cell apoptosis. Concerning anti-inflammation research, ABM-EtOAc and ABM-BuOH subfractions all inhibit LPS-induced TNF-α and IL-1β which released from RAW 264.7. Furthermore, ABM-EtOAc and ABM-BuOH subfractions inhibit COX-2 expression of A549 and HT29 at 50 μg/ml concentration, while constitutive COX-1 expression is not affected. Moreover, the ABM-BuOH subfraction is the best. Thus, these results indicate that ABM-EtOAc and ABM-BuOH subfractions must have some anti-tumor or anti-inflammation active compounds. They inhibit cancer cell growth by promoting apoptosis of cancer cell. The chemical compound of plant has preventative effects on chronic inflammation-related cancer. urthermore, 25 pure compounds are isolated and identified by inhibiting growth of lung cancer and colon cancer. The coixspirolactam A, coixspirolactam B, and coixspirolactam C are newly identified compounds. Caffeic acid, protocatechuic acid, chlorogenic acid, 3-O-coumaroyl-5β-sitostanol, 3-O-caffeoyl-5β-sitostanol, methyl dioxindole-3-acetate and 24,25-oxidocycloartanol are first isolated from adlay. From the anti-tumor activity test, it shows that there are only Caffeic acid, Protocatechuic acid, and Chlorogenic acid have anti-tumor activity in phenolic acid. rom another hand, via anti-inflammation activity, the nine pure compounds, which are not found in ABM-EtOAc, are isolated from ABM-BuOH using many different kinds of isolation technology. Including one Apocarotene: Loliolide, one triterpinoid: 3β-Hydroxyolean-18-en-28-oic acid, one lignan: Pinoresinol, one phenolic ester: (E)-methyl 3,4-dihydroxycinnamate, one sugar-link sterol: β-Sitosteryl-3β-glucopyranoside, one isoflavone: Biochanin A, three flavonoid: 5, 7-Dimethoxy-4''-hydroxyflavan, 4'', 5, 7-Trihydroxyflavone (apigenin), Farrerol, all of the nine pure compounds are first isolated from adlay.第一章、總論 …………………………………………………….…………………... 1、緒言……………………………………………………………………..…...…. 1、文獻整理……………………………………………………………………….. 3、薏苡……………………………………………………………………..…… 3一）薏苡簡介…………………………………………………….………. 3二）薏苡成分…………………………………………………………….. 3三）薏苡生理機能介紹………………………………………………….. 9.調節血糖…………..……………………………………………... 9.調節血壓………………………..……………………………...… 9.抗致突變性…………..…………………………………………... 9.抗氧化作用…………..…………………………………………... 10.內分泌調節作用..………………………………………………... 10.免疫調節與抗發炎作用…………..……………………………... 10.輔助抑制腫瘤作用…………..…………………………………... 11、肺癌及腸癌的科學文獻回顧……………………………………………….. 16一）癌症的流行病學…………………………………………………….. 16二）肺癌………………………………………………………………….. 16三）大腸癌………………………………………………………….……. 17四）COX-2與癌症之關係……………………………………………….. 18.環氧合酶簡介……………..……………………………………... 18.COX-2在致癌過程的角色………………………….…………… 21.COX-2在癌症預防的角色………………………………………. 22、細胞週期……………………………………………………………….…..... 23、細胞凋亡……………………………………………………………….……. 24一）細胞凋亡的定義………………………….…………………………. 24二）細胞凋亡與細胞壞死之區別………………….……………………. 24三）細胞凋亡的機轉………………………………………..………….... 27.粒線體路徑…………………………..…………………………... 28.死亡受器路徑……………………………..………………..……. 30.內質網路徑……………………..……………………………..…. 31、發炎與巨噬細胞………………………………..…………………………… 32、研究動機與目的……………………………………………………………….. 34、實驗設計與架構…………………………………………………………….…. 35二章、薏仁麩皮甲醇萃取物之防癌及免疫調節活性之探討…………………….. 37、前言…………………………………………………………….………………. 38、材料與方法…………………………………………………………….………. 39、實驗材料…………………………………………………………….………. 39一）薏仁麩皮原料……………………………………………………….. 39二）試驗藥品……………………..…………………………………...…. 39三）細胞培養用品………………….……………………………………. 41四）細胞株…………………..…………………………………...………. 42五）儀器設備……………………..………………………………...……. 43、實驗方法…………………………………………………………….………. 44一）薏仁麩皮甲醇萃取物及其不同極性溶劑區分層之製備………….. 44.薏仁麩皮甲醇萃取物之製備……………..……………………... 44.薏仁麩皮甲醇萃取物之溶劑區分之製備…..…………………... 44二）抑癌之生物活性檢測模式………………………………………….. 46.癌細胞毒性或生長抑制活性之生物檢定………………………. 461)試驗樣品對細胞株生長抑制作用之生物檢定-MTT分析…. 462)試驗樣品對細胞株之細胞毒性檢測-LDH分析…………….. 46.癌細胞型態學之觀測……………………………………………. 471)試驗樣品對癌細胞株外觀型態上的影響…………………… 472) 試驗樣品對癌細胞株型態學上的影響-劉氏染色法……… 47.癌細胞死亡模式之生物檢定……………………………………. 481)試驗樣品對癌細胞株DNA integrity分析…………………… 482)試驗樣品對癌細胞株細胞週期之影響……………………… 49.與細胞癌化相關之促發炎COX-2蛋白之檢測……………….… 491)蛋白質的萃取………………………………………………… 492)聚丙烯醯胺膠體電泳法……………………………………… 493)西方轉漬法…………………………………………………… 50三）免疫調節之檢測模式……………………………………………….. 50.抑制LPS/IFN-γ誘導巨噬細胞產生一氧化氮自由基之生物檢定模式………………………………..………………………….. 50.抑制LPS誘導巨噬細胞產生促發炎激素分泌之生物檢定模式. 511)鼠巨噬細胞促發炎激素分泌之生物檢定模式……………… 512) TNF-α及IL-1β酵素免疫連結測定法（ELISA）…………..… 51四）統計分析…………….………………………………...……….……. 52五）實驗設計……………….………………………………..…….…….. 52、結果與討論…………………………………………………………….………. 54、抑癌之相關研究…………………………………………………………….. 54一）薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分之抑癌活性測定-MTT………. 54二）薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分之抑癌活性測定-LDH………. 60三）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層對癌細胞型態學之觀測….. 65四）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層對癌細胞之劉氏染色觀測.. 70五）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層對癌細胞之細胞週期觀察.. 70六）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層對癌細胞DNA片段化分析. 73七）薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分對細胞癌化相關之促發炎COX-2蛋白之表現……………………….………..……………….. 75.薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分層對TPA所誘發A549人類肺癌細胞COX-2蛋白質表現量之影響……………….……... 76.薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分層對TNF-α所誘發HT-29人類大腸癌細胞之COX-2蛋白質表現量之影響…………….. 76.ABM-EtOAc及ABM-BuOH對TPA所誘發A549人類肺腺癌細胞之COX-2蛋白質表現量之影響………………………….. 79.ABM-EtOAc及ABM-BuOH對TNF-α所誘發HT-29人類大腸癌細胞之COX-2蛋白質表現量之影響……………………….. 82、免疫調節活性部分………………………………………………..………… 86一）薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分層對鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞存活率之影響……………………………………………...…. 87二）薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分層對鼠巨噬細胞RAW 264.7一氧化氮釋放量之影響……………………………………...…..... 87三）薏仁麩皮甲醇萃取物不同溶劑區分層對鼠巨噬細胞RAW 264.7促發炎激素分泌之影響……..…………….……………..…….…. 90、結論……………………………………………………………….……………. 95三章、薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯層次區分物之防癌成分之分離與純化….. 97、前言…………………………………………………………....……………….. 98、材料與方法………………………………………..………………………….... 100、實驗材料……………………………...…………………………….……….. 100一）薏仁麩皮原料………………………….…………..………………... 100二）試驗藥品………………………………………..…………….……... 100三）細胞培養用品……………………………………..………………… 101四）細胞株……………………………………..…………………….…... 101五）分離純化用品……………………………………………..………… 102六）儀器設備…………………………………………………………….. 103、實驗方法………………………………………………………...….……….. 104一）薏仁麩皮甲醇萃取物及其不同溶劑極性區分層之製備………….. 104二）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層的矽膠管柱層析………….. 105三）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯區分層之活性次區分物的分離與純化………………………………………………………………… 105四）配合分離純化之TLC spot檢出工作……………………………... 106五）化合物的結構鑑定與分析………………………………………… 106六）抑癌之生物活性檢測模式……………………..…….……………... 107.試驗樣品對細胞株生長抑制作用之生物檢定-MTT分析……... 107.試驗樣品對細胞株之細胞毒性檢測-LDH分析………………... 108七）免疫調節之檢測模式……………………..………………………… 108.抑制LPS/IFN-γ誘導巨噬細胞產生一氧化氮自由基之生物檢定模式……………..…………………………………………….. 108.鼠巨噬細胞促發炎激素分泌之生物檢定模式…………………. 1091)收集含欲測細胞激素之培養基…………………………….... 1092)酵素免疫連結測定法……………………………...…………. 109八）癌細胞之前列腺激素釋放量之檢測……………………………….. 110.收集含欲測前列腺激素之培養基…………..…………………... 110.前列腺素E2（PGE2）濃度測定…………………..……………….. 110九）統計分析…………………………………………………...………... 111十）實驗設計……………………………………………………..…….... 111、結果與討論…………………………………………………………….………. 114、抑癌之相關研究…………………………………...………………………... 114一）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯層次區分物之抑癌活性測定-MTT. 114二）薏仁麩皮甲醇萃取物乙酸乙酯層次區分物之抑癌活性測定-LDH. 119、免疫調節部分……………………………………………………...………... 124一）ABM-EtOAc之次區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞存活率之影響……………..……………………………………………….. 124二）ABM-EtOAc之次區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7一氧化氮釋放量之影響………………………..………………….……………. 127三）ABM-EtOAc之次區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7促發炎激素分泌之影響…………………………..………….…………………. 127、ABM-EtOAc之成分分離………………………………………...…….…… 130、純化合物結構摘要………………………………………………………...... 132、純化合物之結構分析與鑑定……………………………………………..… 139一）化合物PE1：3-O-Coumaroyl-5β-sitostanol………………………... 139二）化合物PE2：3-O-Feruloyl-5β-sitostanol……..………………...….. 143三）化合物PE3：3-O-Caffeoyl-5β-sitostanol…………………..…….… 147四）化合物IFL1：5-Hydroxy-7-methoxy-4''-acetoxylisoflavone………... 151五）化合物T1：24,25-Oxidocycloartanol………..…….……………...…. 155六）化合物O1：(E)-1-(4-Hydroxy-3-methoxyphenyl)dec-4-en-3-one…... 159七）化合物L1：Coixspirolactam A……………………...………...……... 165八）化合物L2：Coixspirolactam B……………….…………..…….….… 173九）化合物L3：Coixspirolactam C………………...……………….….… 181十）化合物L4：Coixlactam…….………..……………...…………..……. 189十一）化合物L5：Methyl dioxindole-3-acetate…..…..…...…………...… 197十二）化合物L6：Coixspirolactone……………………………..…..…… 205、薏仁麩皮分離鑑定出之已知化合物光譜數據…………………………….. 214一）化合物PA1：trans-p-Coumaric acid…………………...…...……….. 214二）化合物PA2：Ferulic acid………………....………………………….. 215三）化合物PA3：Caffeic acid………………....…………………...…….. 216四）化合物PA4：Vanillic acid…………………..………………………... 217五）化合物PA5：Syringic acid………………..…..……………………... 218六）化合物PA6：Protocatechuic acid……………..……………………... 219七）化合物PA7：Chlorogenic acid…………...………….…...………….. 220八）化合物PD1：p-Hydroxybenzaldehyde…………………….………… 221九）化合物PD2：Syringaldehyde……..……...…...………….…..……… 222十）化合物S1：Stigmasterol…………………...…...…..…….…..……… 223十一）化合物S2：β-Sitosterol………………………………..…………... 223十二）化合物S3：Stigmstan-3β-ol……………………………...……...… 224十三）化合物S4：3β-Hydroxystigmast-5-en-7-one…...…….…..….….… 225、純化物質對癌細胞株生長抑制作用………………………...…...……….... 226、純化物質對癌細胞前列腺激素釋放量之影響…………………………….. 227一）純化物質對TPA所誘發A549人類肺癌細胞之前列腺激素釋放量之影響…………..…………………………………...……………. 227二）純化物質對TNF-α所誘發HT-29人類大腸癌細胞之前列腺激素釋放量之影響………………………………..………………….….. 229、結論……………………………………………………..……………………… 232四章、薏仁麩皮甲醇萃取物正丁醇層次區分物之抗發炎活性成分之分離與純化…………………………………………………………………………… 235、前言………………………………………………………..….………….…….. 236、材料與方法…………………………………………………………...….…….. 238、實驗材料……………………………………………………..…….….…….. 238一）薏仁麩皮原料………………………….…………………..………... 238二）試驗藥品………………………….…………………..……….…….. 238三）細胞培養用品……………………………………………...………... 238四）細胞株…………….……………………………………………...….. 239五）分離純化用品……………………………………………………….. 239六）儀器設備………………………….………………………………..... 239、實驗方法…………………………………………………………..……….... 241一）薏仁麩皮甲醇萃取物及其不同極性區分層之製備……………….. 241二）薏仁麩皮甲醇萃取物正丁醇區分層之活性次區分物的分離純化.. 241三）配合分離純化之TLC spot檢出工作……………………………….. 242四）化合物的結構鑑定與分析………………………………………….. 242五）抑制LPS/IFN-γ誘導巨噬細胞產生一氧化氮之生物檢定模式…… 243六）實驗設計…………………………………………………………….. 244、結果與討論…………………………………………………………………..… 246、ABM-BuOH經Diaion HP-20樹脂層析分離後之次區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7一氧化氮釋放量之影響……………………………………… 246一）ABM-BuOH之次區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7細胞存活率之影響……………………………………………..……………….. 249二）ABM-BuOH之次區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7一氧化氮釋放量之影響………………………………………………..……….. 249三）ABM-BuOH-F、G、H細區分物對鼠巨噬細胞RAW 264.7一氧化氮釋放量之影響………………………………………………… 250、ABM-BuOH之成分分離……………………………………………………. 258、純化合物結構摘要………………………………………………………….. 260、純化合物之結構分析與鑑定……………………………………………….. 263一）化合物AP1：Loliolide…………………………………………..…… 263二）化合物LG1：Pinoresinol……………………...………………..……. 266三）化合物T2：3β-Hydroxyolean-18-en-28-oic acid…………………... 270四）化合物SP1：β-Sitosteryl-3β-glucopyranoside……..……………... 274五）化合物PE4：(E)-Methyl 3,4-dihydroxycinnamate……….…………. 277六）化合物FL1：5, 7-Dimethoxy-4''-hydroxyflavan……………………... 281七）化合物FL2：4'', 5, 7-Trihydroxyflavone (apigenin)…………………. 285八）化合物FL3：Farrerol………………………………….…….….…..... 288九）化合物IFL2：Biochanin A………………….……………………..… 292、結論……………………………………………..……………………………… 295五章、綜合討論………………………………………………..…………………… 297、薏仁麩皮中的植物化學成分及含量………………………………………….. 297、薏仁麩皮中植物化學成分防癌作用之可能機轉…………………………….. 301、薏苡中植物化學成分防癌作用及免疫調節作用…………………………….. 304、薏苡中特殊成份Lactam之抗癌文獻討論………...………………………….. 313、總結……………………………………………………..……………………… 315考文獻………………………………………………………..…………………….. 31