The sleep Disturbance in Rats with Parkinsonism

帕金森氏症 (Parkinson’s Disease, PD) 於1817年由英國的帕金森醫師發表的病例報告之後，世人開始注意到這些患者。在許多人投入帕金森的研究之後，針對帕金森症患者的大腦進行種種實驗，發現患者腦中紋狀體 (striatum) 的多巴胺含量顯著少於正常人，進一步分析則發現，多巴胺減少是由於患者黑質 (substantia nigra, SN) 所存活分泌多巴胺的神經元大量減少，並由此結果得知帕金森患者所出現的眾多症狀皆起因於此。研究關心的重點在帕金森患者所產生的睡眠症狀上，這個部分較不為一般人所重視，有許多症狀產生的機轉仍待研究人員進一步了解。我們試著將藥物直接施打於大鼠大腦黑質處，阻斷黑質附近ubiquitin-proteasome system之功能，造成被ubiquitin結合的蛋白質無法經由proteasome分解而大量堆積於位在黑質的多巴胺神經元，而使微膠細胞 (microglia cell) 活化，造成多巴胺神經活性衰退，大鼠上產生類似PD患者的睡眠障礙症狀，並藉由此模式來探討PD患者睡眠產生改變的機轉是否經過微膠細胞活化所釋放之細胞素 (cytokine) 而造成。G-132 (proteasome inhibitor) 施打之後，apomorphine (多巴胺的作用劑) 的測試的確能觀察到大鼠原地轉圈的數目在給予後有增加的現象，證明多巴胺神經元的確有減少釋出多巴胺的情形，並且能產生大鼠的運動障礙。我們分析大鼠EEG的變化，發現MG-132施打後一週，大鼠的睡眠便產生了在活動期睡眠增加，但在睡眠期之睡眠有減少的變化，這與PD患者所產生的睡眠障礙相當類似。此變化經由tumor necrosis factor receptor fragment (TNFRF) 、或是nuclear factor-kappa B (NF-κB) inhibitor的施打，都能令其回復至與控制組接近的睡眠量，而interlukin-1 receptor antagonist (IL-1ra) 對MG-132所造成的增加在大鼠活動期睡眠現象卻無法產生顯著的抑制作用。理論上MG-132的施予能造成大鼠腦中IL-1β及TNF-α在特定幾個影響睡眠的腦區中含量增加，實際上MG-132的確使中腦及下視丘TNF-α的表現量增加，NF-κB的表現也因為MG-132的施打，可看到紋狀體 (striatum) 所偵測到NF-κB有明顯增加活化的情形，而IL-1β的表現在MG-132給予之後並沒有看到顯著的增加。由此可推論，MG-132所導致的睡眠失調，是經過TNF-α-NF-κB這條路徑的改變所造成，而非IL-1β。For patients with the Parkinson’s disease (PD), the degeneration of dopaminergic neurons causes the decrease of dopamine release from the substantia nigra pars compecta (SNpc) to the striatum. It is also found that the PD patient’s brain has inclusion bodies of α-synuclein in this area. These inclusion bodies can lead to activate mitochondrial and to subsequently release cytokines, such as tumor necrosis factor – alpha (TNF-α) and interlukin-1beta (IL-1β), which affect the PD patient’s sleep. We herein used a proteasome inhibitor, MG-132, to inhibit the function of proteasome, which caused the loss of dopaminergic neurons in SNpc, and subsequently changed the sleep architecture in rats. The total amount of NREMS was significantly increased, and the of wakefulness was decreased during the dark-period at the 7th day after MG-132 treatment. We administered tumor necrosis factor receptor fragment (TNFRF) and interlukin-1 receptor antagonist (IL-1ra), to elucidate the involvement of TNF-α and IL-1β in MG-132-induced sleep alteration. The MG-132-induced sleep alteration was reversed after giving those blockers of cytokines. We employed BAY11-7085 and SN50, the nuclear factor-kappa B (NF-κB) inhibitors, to verify the involvement of NF-κB activation. Out results indicated that NF-κB inhibitor also blocked MG-132-induced sleep disturbance. The expression of TNF-α was increase after MG-132 administration, but there has no alteration on IL-1β expression. The activation of NF-κB at the striatum was significantly increased after injection of the MG-132. In this study, we demonstrated that TNF-NF-κB pathway is involved in the mechanism of sleep disturbance in rats with MG-132-induced parkinsonism.中文摘要 …………………………………………………… i文摘要 …………………………………………………… ii. 背景介紹及研究目的 ……………………………………… 1.1 研究歷史 ……………………………………… 1.2 症狀 ……………………………………… 1.3 多巴胺神經路徑 ……………………………………… 1.4 運動路徑 ……………………………………… 2.5 病因 ……………………………………… 3.6 帕金森氏症與細胞素 ……………………………………… 4.7 細胞素與睡眠 ……………………………………… 5.8 帕金森氏症的睡眠研究 ……………………………………… 6.9 動物模式 ……………………………………… 6.10 研究目的 ……………………………………… 7. 材料與方法 ……………………………………… 12.1 實驗材料 ……………………………………… 12.1.1 實驗動物 ……………………………………… 12.1.2 實驗用藥 ……………………………………… 12.2 實驗方法 ……………………………………… 13.2.1 EEG ……………………………………… 13.2.2 EEG資料分析 ……………………………………… 14.2.3 Apomorphine Locomotion Test ……………………… 14.2.4 總活動時間 ……………………………………… 15.2.5 組織學 ………………………………………. 15.2.5.1 Tyrosine Hydroxylase Stain (TH-Stain) …………. 15.2.5.2 Transmission Electron Microscope (TEM) ……… 16.2.6 Enzyme Linked Immunesorbent Assay (ELISA) ……… 17.2.7 NoShiftTM Transcription Factor Assay ………………… 17.2.8 統計學分析 ……………………………………… 18. 結果 ……………………………………… 213.1 帕金森氏症的動物模式 ……………………………………… 21 3.1.1.1 睡眠上的變化 ……………………………………… 21 3.1.1.2 對運動的影響 ……………………………………… 21.1.1.2.1 Locomotion Test …………………………… 21.1.1.2.2 Total moving time …………………………… 213.2 睡眠結構 ……………………………………… 22 3.2.1 TNFRF ……………………………………… 22 3.2.2 IL-1ra ……………………………………… 22 3.2.3 BAY11-7085 ……………………………………… 223.3 睡眠品質 ……………………………………… 223.4 組織學檢驗 ……………………………………… 23.4.1 Tyrosine Hydroxylase Stain (TH-Stain) …………… 23.4.2 Transmission Electron Microscope (TEM) …………… 233.5 細胞素的表現及轉錄因子活化情形 ……………………… 23.5.1 TNF-α and IL-1β ELISA …………………………… 23.5.2 NoShiftTM Transcription Factor Assay ………………… 23. 討論 ……………………………………… 384.1 MG-132的帕金森氏症動物模式 …………………………… 384.2細胞素在此模式中對睡眠的作用 …………………………… 414.3運動症狀的部分 ……………………………………… 42. 結論 ……………………………………… 44. 參考文獻 ……………………………………… 45. 作者小傳 ……………………………………… 53、 圖目錄ig. 1.1正常與帕金森症腦中Nigrastriatal 徑路的變化 …………… 8ig. 1.2 Rotenone及MPTP造成多巴胺神經元死亡示意圖 …………… 9ig. 1.3腦中各項因子與睡眠的關係圖 …………………………… 10ig. 1.4 MG-132大鼠PD模式影響細胞素分泌之機制 …………… 11ig. 2.1大鼠顯微注射及EEG手術各物品放置位置示意圖 ……… 19ig. 2.2 BAY11-7085組EEG記錄時程 …………………………… 19ig. 2.3 TNFRF及IL-1ra組EEG記錄時程 ……………………… 20ig. 3.1 TNFRF對MG-132的PD大鼠dark-period睡眠的作用 … 24ig. 3.2 TNFRF組中MG-132施打後第七天，大鼠之睡眠變化 … 25ig. 3.3 BAY11-7085組中MG-132施打後第七天，大鼠之睡眠變化 26ig. 3.4 IL-1ra組MG-132施打後第七天，大鼠dark-period睡眠變化 27ig. 3.5 TNFRF對MG-132的PD大鼠light-period睡眠的作用 … 28ig. 3.6 IL-1ra對MG-132的PD大鼠dark-period睡眠的作用 … 29ig 3.7 BAY11-7085對MG-132的PD大鼠dark-period睡眠的作用 30ig. 3.8 BAY11-7085對MG-132的PD大鼠light-period睡眠的作用 31ig. 3.9 MG-132施打後第七天各腦區TNF-α表現情形 …………… 32ig. 3.10 MG-132施打後第七天各腦區IL-1β表現情形 …………… 32ig. 3.11 MG-132施打後第七天各腦區NF-κB活化情形 …………… 33ig. 3.12 Tyrosine hydroxylase stain (TH-Stain) ……………………… 36ig. 3.13 Transmission Electron Microscope …………………………… 37、 表目錄ab. 2.1 睡眠狀態判定表 ……………………………………… 20ab. 3.1 BAY11-7085對大鼠slow wave activity (SWA) 的影響 … 33ab. 3.2 IL-1ra對MG-132之PD大鼠睡眠結構的影響 …………… 34ab. 3.3 BAY11-7085對MG-132之PD大鼠睡眠結構的影響 … 3