Simultaneous determination of amoxicillin and ampicillin in feed by liquid chromatography with fluorescence detection

本實驗目的在以高效液相層析法建立同時檢測飼料中安默西林（amoxicillin）及安比西林（ampicillin）的方法。移動相為0.01 M 磷酸二氫鉀緩衝液（pH 2.5）：乙腈（82: 18, v/v），層析管柱使用SymmetryShield® column（RP8, 5μm, I.D. 4.6 × 250 mm），螢光檢測器檢測波長設定為λex 358 nm、λem 440 nm進行檢測。兩種藥物均以三種不同濃度添加於飼料中之平均回收率介於93.28∼102.69 % 及88.35∼106.14 %；回收率之天內及天間變異係數皆在4 % 以下。安默西林及安比西林於飼料中之檢測極限分別為0.3536及0.0269 mg/kg，定量極限分別為1.1787及0.0896 mg/kg。本試驗所建立之檢測方法通過準確度、精密度、專一性、線性等各項確效，可實際應用於檢測飼料中安默西林及安比西林之含量。The study was to develop a high performance liquid chromatography (HPLC) method for determination of amoxicillin and ampicillin in feeds. Fluorescence detector was set at excitation wavelength of 358 nm and emission wavelength of 440 nm. A SymmetryShield® column (RP8, 5 μm, 4.6 × 250 mm I.D.) with a mobile phase consisting of 0.01 M potassium dihydrogen phosphate (pH 2.5)：acetonitrile (82: 18, v/v) was used. The average recoveries of amoxicillin and ampicillin from spiked samples were 93.28 – 102.69 % and 88.35 – 106.14 % with repeatabilities below 4 % R.S.D.. The limits of detection of amoxicillin and ampicillin were 0.3536 and 0.0269 mg/kg, the limits of quantitation were 1.1787 and 0.0896 mg/kg for feed, respectively. Not only the method of validation was performed, but also specificity, reproducibility, precision and accuracy were confirmed. This assay has been applied to the measurement of amoxicillin and ampicillin in feeds.目錄 致謝 I 中文摘要 II 英文摘要（Abstract） III 目次 IV 表次 VII 圖次 VIII 第一章 緒言 1 第二章 文獻探討 2 第一節 乙內醯胺類抗生素介紹與物理化學特性 2 2.1.1 乙內醯胺類抗生素之介紹 2 2.1.2 乙內醯胺類抗生素之物理化學特性 3 第二節 乙內醯胺類抗生素的作用機制、藥物動力學、副作用及相關規定 4 2.2.1 作用機制 4 2.2.2 藥物動力學 4 2.2.3 副作用、毒性及相關規定 5 第三節 青黴素類抗生素萃取及檢測方法之比較 8 2.3.1 檢測方法之比較 8 2.3.2 高效液相層析法之比較 11 2.3.3 樣品萃取和淨化方法比較 16 第三章 材料與方法 20 第一節 試驗材料 20 3.1.1 實驗藥品 20 3.1.2 空白飼料 20 3.1.3 儀器及器具 21 3.1.4 高效液相層析儀 22 第二節 飼料中安默西林及安比西林分析方法之建立 23 3.2.1 1 % 三氟醋酸（TFA，v/v）溶液 23 3.2.2 40 % 甲醇溶液（v/v） 23 3.2.3 標準原液及工作溶液之配製 23 3.2.4 磷酸緩衝溶液之配製 24 3.2.5 衍化溶液之配製 24 3.2.6 標準品儲存穩定度 24 3.2.7 高效液相層析儀之檢測條件 25 3.2.8 衍化步驟 25 3.2.9 衍化評估 26 3.2.10 系統適應性（system suitability）評估 27 3.2.11 飼料前處理之評估 27 3.2.12 藥物間的可能干擾 29 3.2.13 萃取回收（recovery）、重複性（repeatability）及中間精密度（intermediate precision） 30 3.2.14 不同標準曲線之比較 30 第四章 結果 31 第一節 標準品穩定度 31 第二節 衍化評估 31 第三節 系統適應性評估 32 第四節 標準曲線、檢測極限及定量極限 33 第五節 溶劑有機相比例對固相萃取效果之影響 34 第六節 固相萃取匣濃縮效果評估 34 第七節 飼料萃取效果評估 35 第八節 干擾藥物之評估 35 第九節 最佳萃取條件回收、重複性及中間精密度的評估 36 第十節 不同標準曲線之比較 36 第五章 討論 37 總論 43 參考文獻 6