Studies on the Host Range of Muscovy Duck Parvovirus and the Occurrence of Waterfowl Parvovirus Infections

在以往的研究當中，認為鵝小病毒（GPV）為感染鵝及正番鴨，正番鴨小病毒（MDPV），只感染正番鴨而不感染鵝。然而在本實驗室，曾由野外鵝中分離出正番鴨小病毒，為瞭解MDPV的宿主範圍，及感染後在宿主體內分佈、持續及排毒情形，而進行白羅曼鵝及各種鴨隻之人工感染試驗。 白羅曼鵝及正番鴨在人工感染MDPV後，主要在十二指腸、肝臟及腎臟可偵測到MDPV核酸，並均以感染後第14日可在最多種臟器中測得核酸，直到感染後第16、18天仍皆可檢測到MDPV核酸。各品系鴨，包括正番鴨、北京鴨、菜鴨及土蕃鴨在人工感染後亦皆可檢測出MDPV之核酸，並且皆引起高死亡率，尤其其中菜鴨、土蕃鴨及正番鴨。 另外為瞭解水禽小病毒在野外之發生情形，針對雲林鴨場進行追蹤調查研究，結果GPV或MDPV的垂直感染在野外皆有發生，並且可能以GPV較為普遍。 在鴨鵝小病毒台灣株之結構蛋白VP3核酸序列分析方面，結果顯示，GPV台灣株與分離株4株，相似度達97.1-99.8％。而MDPV分離株4株，與匈牙利株相似度僅有88.5-99.0％，變異性較GPV群為大，推測可能與宿主範圍改變相關。In the previous study goose parvovirus (GPV) was regarded to infect goose and Muscovy duck, and the Muscovy duck parvovirus (MDPV) was considered to infect goose only but not Muscovy duck. In our lab, a MDPV strain was isolated from goose. To understand the host range of the MDPV and its distribution in the host, white Roman goose and Muscovy duck were artificial infected with MDPV in this study. After the inoculation of MDPV in white Roman goose and Muscovy duck, the MDPV DNA was mainly detected in liver, small intestinal and kidney. The MDPV DNA was detected in most organs at 14th day post-inoculation (DPI). The MDPV DNA continued to be detected till the end of the study at the 16th and 18th DPI. MDPV DNA could be detected in the Muscovy duck, Pekin duck, tsaiya duck , and mule duck after experimental inoculation. The result showed MDPV could infect Muscovy duck, tsaiya duck, mule duck and Pekn duck and resulting in high mortality. To understand the occurrence of MDPV and GPV in the field, cohort study was performed in the duck farms in Yun-Lin. The results show that the vertical transmission of GPV or MDPV occurred in the field, and the occurrence of GPV might be more common than MDPV. The nucleotide sequence of the structure protein, VP3, of the field strains of MDPV and GPV were analyzed. The results that the similarity of GPV Taiwan strain and the four isolated strains was between 97.1-99.8％. The similarity of MDPV Hungary strain and the four isolated strains was between 88.5-99.0％. The variability was higher in MDPV group than in GPV group.中文摘要----------------------------------------------------------------------------------I 英文摘要---------------------------------------------------------------------------------II 表次-------------------------------------------------------------------------------------VII 圖次------------------------------------------------------------------------------------VIII 第一章 緒言-----------------------------------------------------------------------------1 第二章 文獻探討 第一節歷史背景 1-1鵝小病毒感染症--------------------------------------------------------------------2 1-2 正番鴨小病毒感染症-------------------------------------------------------------2 1-3台灣地區鴨鵝小病毒之感染情形-----------------------------------------------3 第二節 鴨鵝小病毒之特徵 2-1分類-----------------------------------------------------------------------------------3 2-2形態、結構及理化特性-----------------------------------------------------------4 第三節 小病毒之基因體、結構蛋白與非結構蛋白 3-1小病毒之基因體--------------------------------------------------------------------5 3-2小病毒之非結構蛋白--------------------------------------------------------------6 3-3小病毒之結構蛋白-----------------------------------------------------------------6 第四節 鴨鵝小病毒之流行病學 4-1鴨鵝小病毒感染症之宿主範圍--------------------------------------------------7 4-2鴨鵝小病毒之傳播途徑及致病機轉--------------------------------------------7 4-3鴨鵝小病毒感染症之臨床症狀及病理變化-----------------------------------8 第五節 鴨鵝小病毒感染症之診斷、預防及控制 5-1鴨鵝小病毒感染症之診斷及類症鑑別-----------------------------------------9 5-2鴨鵝小病毒感染症之預防及控制----------------------------------------------10 第三章 材料與方法 第一節試驗材料 1-1病毒來源----------------------------------------------------------------------------11 1-2試驗動物----------------------------------------------------------------------------11 第二節試驗方法 2-1病毒增殖與力價測定 2-1.1 病毒增殖-------------------------------------------------------------------------12 2-1.2 病毒力價（TCID50）測定-----------------------------------------------------12 2-2人工感染試驗 2-2.1以正番鴨小病毒感染白羅曼鵝之人工感染試驗--------------------------12 2-2.2以正番鴨小病毒感染不同品系肉鴨及菜鴨之人工感染試驗-----------12 2-2.3 以不同力價之正番鴨小病毒，感染正番鴨及菜鴨之人工感染試驗--13 2-2.4以正番鴨小病毒感染不同日齡白羅曼鵝之人工感染試驗-------------13 2-3病毒核酸之萃取------------------------------------------------------------------13 2-4聚合酶連鎖反應 2-4.1引子(primer)之設計------------------------------------------------------------13 2-4.2增幅核酸-------------------------------------------------------------------------14 2-4.3 PCR產物之電泳分析---------------------------------------------------------14 2-5間接免疫螢光檢測抗體法------------------------------------------------------15 2-6病毒中和試驗(viral neutralization test)---------------------------------------15 2-7原位雜交反應（In Situ Hybridization）-------------------------------------15 2-8統計學分析-----------------------------------------------------------------------17 2-9雲林地區鴨鵝小病毒之分離 2-9.1 病毒核酸之萃取--------------------------------------------------------------17 2-9.2聚合酶連鎖反應---------------------------------------------------------------17 2-9.3增幅核酸------------------------------------------------------------------------17 2-9.4 PCR產物之電泳分析--------------------------------------------------------17 2-9.5 PCR產物之序列分析--------------------------------------------------------18 2-9.6 PCR產物之序列分析--------------------------------------------------------18 2-9.7病毒中和試驗(viral neutralization test)--- --------------------------------18 2-10鴨鵝小病毒台灣株之結構蛋白VP3核酸序列分析 2-10-1台灣分離株來源-------------------------------------------------------------18 2-10-2 病毒核酸之萃取------------------------------------------------------------18 2-10-3聚合酶連鎖反應-------------------------------------------------------------19 2-10-4增幅核酸----------------------------------------------------------------------19 2-10-5 PCR產物之電泳分析-------------------------------------------------------19 2-10-6 PCR產物之序列分析-------------------------------------------------------19 第四章 結果 第一節 病毒增殖 1-1核酸萃取--------------------------------------------------------------------------19 1-2 PCR產物之電泳分析結果-----------------------------------------------------19 第二節 以正番鴨小病毒感染白羅曼鵝之人工感染試驗 2-1以PCR方式檢測正番鴨小病毒在白羅曼鵝及正番鴨體內之分佈----20 2-2以原位雜交法檢測正番鴨小病毒在白羅曼鵝及正番鴨體內之分佈--20 2-3間接免疫螢光檢測抗體法-----------------------------------------------------21 第三節 以正番鴨小病毒感染不同品系肉鴨及菜鴨之人工感染試驗 3-1死亡率-----------------------------------------------------------------------------21 3-2正番鴨小病毒之檢測-----------------------------------------------------------21 3-3中和抗體結果--------------------------------------------------------------------22 第四節以不同力價之正番鴨小病毒，感染正番鴨及菜鴨之人工感染試驗4-1死亡率-----------------------------------------------------------------------------22 4-2正番鴨小病毒之檢測-----------------------------------------------------------22 4-3中和抗體結果--------------------------------------------------------------------23 第五節以正番鴨小病毒感染不同日齡白羅曼鵝之人工感染試驗 5-1死亡率-----------------------------------------------------------------------------23 5-2正番鴨小病毒之檢測-----------------------------------------------------------23 5-3中和抗體結果--------------------------------------------------------------------23 第六節雲林地區鴨鵝小病毒之分佈 6-1小病毒在不同來源及日齡之分佈--------------------------------------------24 6-2中和抗體結果--------------------------------------------------------------------24 第七節鴨鵝小病毒台灣株之結構蛋白VP3核酸序列分析------------------24 第五章 討論--------------------------------------------------------------------------25 圖、表----------------------------------------------------------------------------------30 參考文獻-------------------------------------------------------------------------------57 附錄-------------------------------------------------------------------------------------68 表次 表1. 以PCR及原位雜交法檢測正番鴨小病毒在白羅曼鵝體內之分佈---30 表2. 以PCR及原位雜交法檢測正番鴨小病毒在正番鴨體內之分佈------31 表3. 間接免疫螢光檢測抗體法結果----------------------------------------------32 圖次 圖1. 鴨鵝小病毒增殖PCR產物之電泳分析圖--------------------------------33 圖2. 3日齡白羅曼鵝感染正番鴨小病毒之肉眼病變-------------------------34 圖3. 3日齡白羅曼鵝感染正番鴨小病毒之腸道顯微病變-------------------35 圖4.不同品系3日齡肉鴨、菜鴨及白羅曼鵝口服感染正番鴨小病毒後之累積死亡率-------------------------------------------------------------------------------36 圖5 不同品系3日齡肉鴨、北京鴨、菜鴨及白羅曼鵝口服感染正番鴨小病毒後之中和抗體變化情形-------------------------------------------------------37 圖6. 正番鴨感染不同力價正番鴨小病毒之累積死亡率變化情形--------38 圖7. 菜鴨感染不同力價正番鴨小病毒之累積死亡率變化情形-----------39 圖8. 正番鴨感染不同力價正番鴨小病毒之中和抗體結果變化情形-----40 圖9菜鴨感染不同力價正番鴨小病毒之中和抗體結果變化情形----------41 圖10不同日齡之白羅曼鵝感染正番鴨小病毒之累積死亡率--------------42 圖11 不同日齡之白羅曼鵝感染正番鴨小病毒之中和抗體變化情形-----43圖12. 雲林地區北京鴨場之鵝小病毒PCR偵測結果------------------------44 圖13. 雲林地區北京鴨場之正番鴨小病毒PCR偵測結果------------------45 圖14. 雲林地區北京鴨場之鵝小病毒中和抗體變化情形-------------------46 圖15. 雲林地區北京鴨場之正番鴨小病毒中和抗體變化情形-------------47 圖16. 雲林地區正番鴨場之鵝小病毒PCR偵測結果------------------------48 圖17. 雲林地區正番鴨場之正番鴨小病毒PCR偵測結果------------------49 圖18. 雲林地區正番鴨場之鵝小病毒中和抗體變化情形-------------------50 圖19. 雲林地區正番鴨場之正番鴨小病毒中和抗體變化情形-------------51 圖20 鴨鵝小病毒台灣株之結構蛋白VP3 (3080bp至4638bp)之部分核酸序列比對圖-------------------------------------------------------------------------------52 圖21. 鴨鵝小病毒台灣株之結構蛋白VP3核酸序列相似性(identity)與相異度(divergence)百分比----------------------------------------------------------------56 附錄 附錄一：培養初代鴨腎臟細胞-----------------------------------------------------68 附錄二：病毒核酸之萃取-----------------------