Development of Analytical Methods and Residual Study of Florfenicol in Animals

台灣在加入世界貿易組織(WTO)後，禽畜水產品的進出口量明顯增加，而國際上對禽畜水產品的品質要求提高，更加重視肉品衛生安全，因此藥物殘留檢測更是不容忽視且相當重要的一環。氟甲磺氯黴素(florfenicol，FF)是屬於氯黴素類藥物，化學構造類似氯黴素(chloramphenicol，CAP)，其具有良好生物利用率，組織分佈率與抗菌範圍亦比氯黴素廣；目前普遍應用在禽類、豬及牛的疾病治療上，也被各國列為藥物殘留檢驗藥品之一。 本研究已設計開發HPLC與ELISA二套快速檢驗氟甲磺氯黴素(florfenicol)之標準流程及檢測套組，HPLC分析方式建立FF藥物殘留組織萃取方法及分析資料，組織中藥物濃度檢測敏感度為100 ng/mg，香魚肌肉回收率為81%。另一方面利用化學合成技術設計FF的半抗原、抗原、免疫原與FF酵素結合體(enzyme conjugate)，自行製備多株抗體，抗體敏感度為0.3 ng/mL；經過穩定性測試後成功建立competitive ELISA kit 雛型套組。並比對其他類抗生素與FF ELISA kit 的交叉反應度結果顯示CAP、TAP的交叉反應為9.54 %與9.53 %，與其他類抗生素交叉度皆小於1 %。利用研發套組，已完成市售吳郭魚組織藥物殘留檢測與石斑魚殘留期試驗；在市售吳郭魚檢測方面並未檢測到FF的殘留(檢測敏感度為0.3 ng/mg，回收率97 %)；10 mg/kg一次口服投與石斑魚殘留期試驗方面，停藥後48小時肌肉組織殘留濃度為379 ng/mg；其他停藥時間點(60小時、72小時、84小時、96小時)之肌肉組織殘留濃度分別為49 ng/mg、42 ng/mg、4.22 ng/mg與7.58 ng/mg (最低檢測敏感度為0.3 ng/mg，魚肉樣品回收率為97 %)。本研究所建立的兩套檢測模式可供未來藥物檢測單位之應用。Florfenicol (FF), a derivative of chloramphenicol, is a broad spectrum antibiotic approved for use in livestock, poultry, and aquaculture. The drug is approved for use in animal for the treatment of bacterial infection, but the residues of FF in consumable meat pose potential risks for public health because of the increasing incidence of microbial resistance. We had developed ELISA and HPLC methods to examine the FF residue in animals, especially in ayu, tilapia, chicken, and pork. At HPLC, the LOD was 0.1 ug/mg, and the analytical average retrieve of FF in ayu’s muscle was 81%. When FF was giving to ayu in measuring medicine of hurl a time with 10, 20 and 50 mg/kg then the concentration distribution in muscle detected. The withdrawal times were 72, 96 and 96 hours, respectively. In order to raise the polyclonal antibody of FF for used in ELISA testing, we synthesize the hapten, antigen and immunogen of FF. The chemical structure of the synthetic hapten was confirmed by Nuclear Magnetic Resonance (NMR) (Brucker 500 MHz). The hapten-HRP conjugate was synthesized with the suitable hapten/HRP ratio. The cross-reactivity of the other analogue is determined by the florfenicol ELISA. The limit of detection (LOD) was 0.3 ng/mL. Cross reactivity with thiamphenicol, chloramphenicol, amoxicillin, penicillin G, chlortetracycline, tetracycline, gentamicin and streptomycin were 9.53%, 9.54%, <1%, <1%, <1%, <1%, <1%, and <1%, respectively. And that, the kit were applicable on the FF residual examination of fish. In conclusion, we have developed HPLC method and the sensitive florfenicol ELISA set for which FF could efficiently be detected.目錄 中文摘要---------------------------------------------- I 英文摘要---------------------------------------------- II 英文縮寫對照表---------------------------------------- III 目錄-------------------------------------------------- V 圖次------------------------------------------------- VII 表次-------------------------------------------------- X 第一章 緒言---------------------------------------- 1 第二章 文獻探討------------------------------------ 3 第一節 氟甲磺氯黴素 (Florfenicol， FF)的化學特性及藥理作用----- 3 第二節 高效液相層析分析----------------------------------------------------- 10 第三節 酵素連結免疫吸附法-------------------------- 13 第三章 材料與方法---------------------------------- 21 一、高效液相層析分析------------------------ 21 二、酵素連結免疫吸附檢驗試劑之開發---------- 24 第四章 結果---------------------------------------- 37 一、高效液相層析分析------------------------ 37 第一節 高效液相層析條件設定------- 37 第二節 標準曲線之建立------------- 37 第三節 樣品回收率試驗------------- 37 第四節 Florfenicol在香魚組織之藥物分佈與殘留時間---------- 39 二、酵素連結免疫吸附檢驗試劑之開發----------- 39 第一節 FF半抗原之檢測、抗原與免疫原製備---------------------- 39 第二節 抗體分析與純化------------- 40 第三節 多株抗體與酵素結合體稀釋倍數及檢測敏感度----------- 42 第四節 雛形套組之量產------------- 42 第五節 套組安定性試驗------------- 43 第六節 藥物交叉反應率------------- 44 第七節 組織樣品回收率------------- 45 第八節 市場販售吳郭魚之FF殘留調查- 45 第九節 FF在石斑魚殘留性試驗------- 46 第五章 討論----------------------------------------- 70 參考文獻---------------------------------------------- 78 附錄-------------------------------------------------- 8