Expression and Characterization of Sweet Potato (Ipomoea batatas (L.) Lam) Sucrose Phosphate Synthase in Yeast(Pichia pastoris)

中文摘要 蔗糖磷酯合成酶 (sucrose phosphate synthase) 是蔗糖生合成中一個極為重要的調控酵素，本論文以甘藷塊根蔗糖磷酯合成酶之 cDNA 作為材料，於酵母菌 (Pichia pastoris) 中進行重組表現。所得表現之蔗糖磷酯合成酶，單體分子量為 50 kD，此結果和實際甘藷塊根中，蔗糖磷酯合成酶單體之分子量 (120 kD)，相差一倍，反而與甘藷葉片純化出之蔗糖磷酯合成酶者相近。 而在生化性質分析中，對於異位調控因子影響方面，表現之重組蔗糖磷酯合成酶性質，與甘藷塊根蔗糖磷酯合成酶並不相同，而卻與甘藷葉片之蔗糖磷酯合成酶相似：葡萄糖 6-磷酯 (G 6-P)能活化此蔗糖磷酯合成酶，而無機磷酸鹽 (Pi)則抑制之。最適反應 pH 值實驗中，發現本論文表現之重組蔗糖磷酯合成酶最適 pH 值為 7，其與其他組織內以及真核原核系統表現之蔗糖磷酯合成酶相同，都屬於中性的酵素，並且在酸性與鹼性環境中，呈現不穩定之現象。至於金屬離子對本論文表現之重組蔗糖磷酯合成酶之影響，Ca2+、Co2+ 及 K+ 離子能活化它，而 Na+ 離子則會抑制其活性。此結果類似於甘藷葉片中的蔗糖磷酯合成酶，而非甘藷塊根中之蔗糖磷酯合成酶。因此推論甘藷蔗糖磷酯合成酶，在甘藷中可能沒有其他同功異構酶，而其在各器官或組織中，會產生結構與調控方式之差異，極可能是轉譯後修飾作用後所造成之結果。目錄…………………………………………………………………………………..Ⅰ 縮寫表……………………………………..……………………………….………Ⅳ 中文摘要…………………………...………………………….…………………….ⅤI 第一章 緒論…………………………………………………………………………. 1 1.1 蔗糖的重要性………………………………………………………….…….1 1.2 蔗糖的生合成………………………………………………………………..2 1.3 蔗糖在植物體內的運輸……………………………………………………..3 1.4 蔗糖磷酯合成酶……………………………………………………………..4 1.5 蔗糖磷酯合成酶激酶與蔗糖磷酯合成酶磷酯酶…………………………..8 1.6 蔗糖磷酯合成酶之分子生物學研究………………………………………10 1.7 蔗糖磷酯合成酶的酵素複合體……………………………………………11 1.8 蔗糖磷酯合成酶在轉殖植物上的研究……………………………………12 1.9 實驗緣起……………………………………………………………………13 第二章 材料與方法………………………………………………………………...14 2.1 實驗材料……………………………………………………………………14 2.1.1 植物材料……………………………………………………………..14 2.1.2 菌株…………………………………………………………………..14 2.1.3 載體…………………………………………………………………..14 2.2 實驗藥品……………………………………………………………………16 2.2.1 一般化學試劑………………………………………………………..16 2.2.2 限制酶及核酸修飾酵素……………………………………………..16 2.2.3 培養基………………………………………………………………..17 2.3 實驗儀器……………………………………………………………………17 2.3.1 離心機………………………………………………………………..17 2.3.2 分光光度計…………………………………………………………..17 2.3.3 恆溫培養箱、恆溫水浴槽………………………….………………..17 2.3.4 pH meter …………………………………………….……………….17 2.3.5 UV照相系統………………………………………….………………17 2.3.6 水平電泳槽、鑄膠槽………………………….…….……………….17 2.3.7 蛋白質電泳槽、鑄膠槽……………………………………………....17 2.3.8 超音波震盪機………………………………………………………..18 2.4 表現載體之建構……………………………………………………………18 2.4.1 核酸引子之設計……………………………………………………..18 2.4.2 質體 DNA 之抽取…………………………………………………..18 2.4.3 聚合酶鏈鎖反應 (polymerase chain reaction，PCR)…………...19 2.4.4 T-A cloning 法………………………………………………………..19 2.4.5 接合反應……………………………………………………………..19 2.4.6 DNA 洋菜膠體電泳法……………………………………………….20 2.4.7 質體 DNA 之轉形與篩選…………………………………………..20 2.4.7.1 培養基之製備………………………………………………….20 2.4.7.1.1 液態培養基………………………………………………20 2.4.7.1.2 固態培養基………………………………………………20 2.4.7.2 勝任細胞之製備……………………………………………….21 2.4.7.3 質體之轉形…………………………………………………….22 2.4.7.4 轉殖株之篩選………………………………………………….22 2.4.7.5 質體快速檢定法……………………………………………….22 2.4.7.6 菌落聚合酶鏈鎖反應檢定法………………………………….23 2.4.7.7 菌種之保存…………………………………………………….23 2.5 誘導表現之重組蛋白質……………………………………………………23 2.5.1 重組蛋白質之表現…………………………………………………..23 2.5.2 表現之重組蛋白質的純化…………………………………………..24 2.6 蛋白質之基本分析方法……………………………………………………24 2.6.1 蛋白質定量法………………………………………………………..24 2.6.2 電泳檢定系統………………………………………………………..25 2.6.2.1 原態膠體電泳………………………………………………….25 2.6.2.2 SDS-膠體電泳……………………………………………….28 2.6.3 蛋白質電泳轉印法…………………………………………………..30 2.6.4 膠體染色法…………………………………………………………..31 2.6.5 膠片乾燥法…………………………………………………………..33 2.6.6 膠體過濾法…………………………………………………………..34 2.7 表現之重組蔗糖磷酯合成酶基本生化性質分析方法……………………35 2.7.1 蔗糖磷酯合成酶活性測定…………………………………………..35 2.7.2 最適反應溫度………………………………………………………..37 2.7.3 最適 pH 值測定…………………………………………………….38 2.7.4 不同 G 6-P 濃度對酵素活性的影響………………………………39 2.7.5 不同 Pi 濃度對酵素活性的影響…………………………………...39 2.7.6 不同金屬離子對酵素活性的影響…………………………………..40 2.7.7 不同代謝物質對酵素活性的影響…………………………………..41 第三章 結果與討論………………………………………………………………...42 3.1 甘藷塊根蔗糖磷酯合成酶 cDNA 表現載體之建立…………………….42 3.1.1 引子之設計………………………………………………………………42 3.1.2 聚合酶鏈鎖反應……………………………………………………..44 3.1.3 保存型載體之建立…………………………………………………..45 3.1.3 表現型載體之建立…………………………………………………..48 3.2 表現載體重組入 Pichia pastoris 之結果探討………………………….53 3.3 表現之重組蛋白質在 Pichia pastoris 中最適表現條件探討………….55 3.4 表現之重組蛋白質之純化探討……………………………………………57 3.5 重組表現之蔗糖磷酯合成酶的生化性質探討……………………………59 3.5.1 G 6-P 與 Pi 對蔗糖磷酯合成酶活性之影響………………………59 3.5.2 表現之重組蔗糖磷酯合成酶最適 pH 值探討…………………….60 3.5.3 不同金屬離子對表現之重組蔗糖磷酯合成酶之影響探討………..61 第四章 結論與展望………………………………………………………………...63 4.1 重組蔗糖磷酯合成酶之表現載體建構……………………………………63 4.2 表現之重組蔗糖磷酯合成酶之純化………………………………………63 4.3 表現之重組蔗糖磷酯合成酶之生化性質…………………………………65 4.4 未來展望……………………………………………………………………65 參考文獻…………………………………………………………………………….6