Production of Candida rugosa lipase 3 by Pichia pastoris using fed-batch cultivation in synthetic medium

使用中央研究院植物暨微生物學研究所蕭介夫教授研究室所構築之 Pichia pastoris GS115/CRL3，以前人研究結果 (侯，2006；李，2007) 為基礎，進一步探討 Candida rugosa 脂肪酶三 (CRL3) 於五公升桌上型醱酵槽大量表現之最適條件。以修改過之 YPG 複合培養基在 700 rpm、25oC、pH 6 下批次培養至 48 小時，培養液之菌體濃度 (OD600 nm) 152，CRL3 活性 84 U mL-1，蛋白酶活性 0.22 U mL-1。使用 FM22 全合成培養基在相同條件下，培養液之 OD600 nm 78，CRL3 活性 23 U mL-1，細胞體積變小，但測不出蛋白脢活性，也發現菌體生長與 histidine 添加量有關。以補充 3 g L-1 histidine 之 FM22 為起始培養基，含 2 g L-1 histidine 之 50% 甘油為饋料液，當起始培養基中甘油用盡時開始以固定速率添加饋料液。在 1000 rpm、25oC、pH 5.0、饋料速率 16.6 mL h-1，饋料批次培養 192 小時培養液之細胞乾重 123.4 g L-1 (OD600 nm 590)，CRL3 活性 342.8 U mL-1，較前人 (侯，2006) 於複合培養基饋料批次培養之結果，菌體量增加 3 倍，酵素活性增加 0.7 倍。Pichia pastoris GS115/CRL3, constructed by Prof. Shaw’s lab, Institute of Plant and Microbial Biology, Academia Sinica, is used to produce Candida rugosa lipase 3 (CRL3). Batch cultivation was demonstrated in a 5-L bench-top fermentor containing complex medium of YPG modified by our previous studies. After 48 h cultivation, cell density of OD600 nm 152, CRL3 activity of 84 U mL-1 and protease activity of 0.22 U mL-1 were obtained under culture conditions of 700 rpm, 25oC and pH 6.0. While a synthetic medium of FM22 was used, cell densities of OD600 nm 78 and CRL3 activity of 23 U mL-1 were obtained under the same conditions. Histidine requirement for cell growth and smaller cells with no protease activity were also found. A fed-batch fermentation process was then developed using FM22 supplemented with 3 g L-1 histidine as an initial medium. At the depletion of the batch glycerol, fed-batch phase was started by feeding a 50% glycerol solution containing 2 g L-1 histidine at a constant feeding rate of 16.6 mL h-1. After 192 h cultivation, cell density of 123.4 g L-1 DCW (OD600 nm 590) and CRL3 activity of 342.8 U mL-1 were achieved under 1000 rpm, 25oC, and pH 5.0. The yield of biomass and CRL3 activity were improved 3-fold and 0.7-fold, respectively, compared with our previous studies using complex medium in a fed-batch strategy.圖次 v 表次 vii 縮寫表 viii 第一章 前言 1 1.1. 脂肪脢簡介 1 1.1.1. 生化特性 1 1.1.2. 催化反應 (圖 1.2) 4 1.1.3. 結構特性 4 1.1.4. 應用性 9 1.2. Candida rugosa 脂肪脢 (CRL) 13 1.3. 嗜甲醇酵母菌Pichia異源蛋白表現系統 15 1.3.1. 嗜甲醇酵母菌Pichia pastoris表現系統的優點 15 1.3.2. Pichia pastoris 利用甲醇的代謝途徑 17 1.3.3. 酒精氧化脢啟動子 (AOX promoter) 20 1.3.4. 甘油醛-3-磷酸脫氫脢啟動子 (GAP promoter) 20 1.4. 高細胞密度培養 21 1.5. 饋料批次培養之控制原理 23 1.6. 研究動機與目的 23 1.7. 研究架構 25 第二章 材料與方法 26 2.1. 使用菌株與載體 26 2.2. 藥品與試劑 26 2.3. 儀器設備 26 2.4. 培養基 27 2.5. 菌株保存方法 28 2.6. 五公升醱酵槽之培養方法 31 2.6.1. 菌種活化及種培養 31 2.6.2. 醱酵槽操作程序 31 2.6.3. 批次培養 (batch culture) 32 2.6.4. 饋料批次培養 (fed-batch culture) 32 2.7. 分析方法 32 2.7.1. 菌體生長量測定 (OD600 nm) 32 2.7.2. 菌體乾重與標準曲線 33 2.7.3. 蛋白質膠體電泳 33 2.7.4. 甘油濃度分析方法 38 2.7.5. 脂肪脢酵素活性分析 38 2.7.6. 蛋白質定量法 40 2.7.7. 蛋白酶活性分析 40 2.7.8. 活細胞之測定 44 第三章 結果與討論 45 3.1. 批次培養 45 3.2. 饋料批次培養 52 3.2.1. 饋料液組成 52 3.2.2. 醱酵槽轉速 56 3.2.3. 饋料速率 59 3.2.4. 培養溫度 59 3.2.5. 活細胞之測定與蛋白酶分析 59 三、 結論 65 第四章 參考文獻 67 圖次 圖 1.1 脂肪脢催化水解三酸甘油酯之反應式 3 圖 1.2 脂肪脢催化反應 5 圖 1.3 ahydrolases 之構造 7 圖 1.4 P. pastoris高細胞密度培養液 15 圖 2.1 表現載體 pGAPZaC-CRL3 28 圖 2.2 本實驗使用菌株 Pichia pastoris GS115 之顯微照相 29 圖 2.3 以超音波震盪處理不同時間測得 OD600 nm 比較 33 圖2.4 L-tyrosine標準曲線 41 圖 3.1 以 YPG 培養基不同溫度下批次培養結果 46 圖 3.2 以 YPG 批次培養之培養液電泳分析 47 圖 3.3 以全合成培養基 FM22 批次培養 48 圖 3.4 補充 1 g L-1 histidine 之全合成培養基批次培養。 49 圖 3.5 全合成培養基 FM22 沈澱物附著於醱酵槽體 50 圖 3.6 轉速設定為700 rpm、pH 5 之批次饋料培養結果 52 圖 3.7 批次饋料培養結果 (於 36 小時饋料) 53 圖 3.8 饋料液添加 2 g L-1 histidine 之批次饋料培養結果 54 圖 3.9 設定不同轉速下批次饋料培養結果 56 圖 3.10 批次饋料培養液電泳分析 57 圖 3.11 提升饋料速率 (1.3 x) 批次饋料培養結果 59 圖 3.12 高細胞密度培養液 1 mL 經 12,000 x g 離心 10 分鐘後照相圖 60 圖 3.14 批次饋料培養液電泳分析 62 圖 3.15甲基藍於不同培養基染色照相圖 63 表次 表 1.1 哺乳動物、真菌及細菌來源之脂肪脢 2 表 1.2 脂肪脢在工業上之應用 11 表 1.3 五種 Candida rugosa 脂肪脢之生化特性比較 13 表 1.4 以 Pichia pastoris為宿主表現各種異源蛋白的產量 17 表 1.5 酵母菌 Pichia pastoris 菌株表現型 18 表 3.1 批次饋料培養結果比較 6