Effect of Medium Milling on Kinetics of Enzymatic Hydrolysis of Cellulose

纖維素為地球上存量最多的多醣類，廣泛應用在食品、紙及能源等方面，具有極高的經濟價值。近年來，將纖維素降解成最小單位－葡萄糖，再進而醱酵成乙醇成為生質能為一熱門話題。本研究主旨為探討介質研磨對酵素水解纖維素的影響。實驗原料為高結晶的棉花纖維，體積平均粒徑為25.52 μm，經介質研磨後，體積平均粒徑下降至1 ~ 10 μm的範圍。利用不同纖維素濃度和研磨時間，製備不同平均粒徑之纖維素，再進行酵素水解反應，藉由葡萄糖(glucose)和纖維二糖(cellobiose)生成量的動力學模式，探討介質研磨對水解反應的影響。 將15 g、35 g纖維素原料與500 mL去離子水(即濃度3 %及7 %)，以0.3 mm的釔鋯珠作為介質，研磨0、15、60、120分鐘後，3 %纖維素研磨濃度的體積平均粒徑分別為25.52 μm、5.54 μm、0.85 μm、0.78 μm，結晶度指數分別為94.4 %、87.5 %、74.3 %、77.0 %；7 %纖維素研磨濃度的體積平均粒徑分別為25.52 μm、6.08 μm、2.66 μm、2.07 μm，結晶度指數分別為94.4 %、87.6 %、76.0 %、86.5 %。經介質研磨後之纖維素加入來自里氏木黴(T. reesei) 之纖維素酶20 mg於40˚C 100 mL的醋酸鈉緩衝溶液中進行水解。結果顯示，動力常數Km與纖維素平均粒徑及結晶度呈正相關，水解速率、Vmax與纖維素平均粒徑及結晶度呈負相關，抑制常數Ki則無明顯趨勢。經研磨後平均粒徑0.78 μm之纖維素，Vmax由0.076 g/L-min提高至0.304 g/L-min，Km由9.844 g/L下降為1.877 g/L，Ki則由0.034 g/L變為0.016 g/L；在E/S (Enzyme/Substrate) = 0.08、120 ~ 200小時水解後，葡萄糖最終產率由50 %上升至90 %。觀察24小時內的水解，葡萄糖產率隨纖維素平均粒徑及結晶度下降而上升，葡萄糖產率自14.22 %提高約3倍至45.83 %。經120分鐘研磨的纖維素，只需1/4酵素量，即達到未研磨纖維素的葡萄糖產率。Cellulose is the most abundant polysaccharide on the earth and is generally applied to foods, fuel, biomaterials and energy. Degradation of cellulose to glucose, which is then fermented to ethanol, is one of the hottest issues in the past decade. The objective of this study is to investigate the effect of medium milling on the kinetics of enzymatic cellulose hydrolysis. The volume average particle size of raw cellulose was reduced from 25.52 μm to 1 ~ 10 μm. Different concentration of cellulose and milling time produced cellulose with various average particle sizes for further enzymatic hydrolysis. Kinetics of glucose and cellobiose production was applied to explore the effect of milling on cellulose hydrolysis. 15 g or 30 g cellulose and 500 mL deionized water (i.e. 3 % or 7 %) were milled by milling medium, YTZ (yttria-stabilized tetragonal zirconia) beads with average diameter 0.3 mm. After 0, 15, 60 and 120 min milling, volume average particle size of 3 % cellulose was 25.52 μm, 5.54 μm, 0.85 μm and 0.78 μm, respectively, and crystallinity index was 94.4 %, 87.5 %, 74.3 % and 77.0 %, respectively; while for 7 % cellulose, volume average particle size was 25.52 μm, 6.08 μm, 2.66 μm and 2.07摘要 I Abstract II 目錄 III 圖目錄 VI 表目錄 X 1. 緒論 1 1.1 前言 1 1.2 實驗目的 1 2. 文獻整理 3 2.1 纖維素 3 2.2 降解纖維素的方法 9 2.2.1 物理法 9 2.2.2 化學法 9 2.2.3 酵素法 13 2.3 研磨法 17 2.4酵素法纖維素水解 19 2.4.1 纖維素酶－里氏木黴(Trichoderma reesei) 19 2.4.2 影響因子 20 2.4.3 酵素水解纖維素的動力方程式 21 2.5 纖維素結晶度測定法 26 3. 材料與方法 29 3.1 材料 29 3.2 試藥 29 3.3 標準品 29 3.4 其他材料 30 3.5 裝置與儀器設備 30 3.6 實驗流程 33 3.6.1 原料濃度 34 3.6.2 機械研磨纖維素 34 3.6.3 酵素水解動力試驗 36 3.6.4 酵素水解產率分析 37 3.6.5 纖維素粒徑分析 38 3.6.6 纖維素結晶度測定 39 3.6.7 固形物含量 40 3.6.8 醣類分析與定量 41 3.6.9 動力模式分析 42 4. 結果與討論 43 4.1 經介質研磨纖維素之性質分析 43 4.1.1 纖維素之粒徑分析 43 4.1.2 纖維素之結晶度分析 47 4.1.3 研磨後纖維素懸浮液之醣類含量分析 51 4.2 酵素水解纖維素之分析 55 4.2.1 纖維素水解之途徑 55 4.2.2 研磨對纖維素水解動力學之影響 57 4.2.3 研磨對纖維素水解產率之影響 75 4.3 研磨預處理在酵素纖維素水解的經濟效益 88 5. 結論 91 6. 參考文獻 93 7. 附錄 98 7.1 Michaelis-Menten 模式 98 7.2 酵素抑制機制 101 7.3 酵素失活方法 103 7.4 濃度計算方法 10